阮越勇，張浩軍，疏欣楊，王蓓蕾，張紓難，2?

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，北京 100029；2.國(guó)家呼吸疾病臨床研究中心，中日友好醫(yī)院 呼吸中心中醫(yī)肺病，北京 100029；3.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029）

彌漫性間質(zhì)性肺疾?。↖LD）或稱肺纖維化，為最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[1]。 之前觀點(diǎn)認(rèn)為肺間質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖，是由于進(jìn)行性炎癥、炎癥細(xì)胞侵襲、細(xì)胞因子失衡誘導(dǎo)的[2]。近些年來(lái)，大量研究報(bào)道，尤其是特發(fā)性肺纖維化和間質(zhì)性肺炎，炎癥反應(yīng)不一定是必要條件，而肺泡上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelialmesenchymat transition，EMT） 和信號(hào)傳導(dǎo)通路在誘導(dǎo)肺纖維化中的作用逐步獲得了認(rèn)可[3，4]。 EMT是一種生物學(xué)現(xiàn)象，其中上皮細(xì)胞在某種病理生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞。它由3 個(gè)類(lèi)型組成，凡是涉及修復(fù)創(chuàng)傷、組織再生和器官功能障礙，歸類(lèi)為2 型EMT，主要生物學(xué)功能是修復(fù)成纖維細(xì)胞和由于創(chuàng)傷和炎癥狀況引起的組織損傷[1，5，6]。雖然體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在肺、腎、肝臟等臟器纖維化進(jìn)程中是否存在EMT 仍存在爭(zhēng)議，但體外研究中EMT 的發(fā)生已被證實(shí)[2]。 作為一種多功能生長(zhǎng)因子，人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 （transforming growth factor-β1，TGFβ1）可在各種上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT，包括肺、肝、腎上皮細(xì)胞，被認(rèn)為是器官纖維化的“總開(kāi)關(guān)”[3]。EMT 涉及腫瘤侵襲和纖維化發(fā)生發(fā)展，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的重視[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TGF-β1 刺激A549 細(xì)胞，分析不同時(shí)間點(diǎn)，從細(xì)胞外形至基因蛋白的表達(dá)，探索是否存在時(shí)間的依賴性，從而進(jìn)一步了解TGFβ1 誘導(dǎo)EMT 發(fā)生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

A549 上皮細(xì)胞系，購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。 F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)買(mǎi)自Gibco 公司；DMSO（dimethyl sulfoxide）購(gòu)自Amresco 公司；MTT 購(gòu)自Sigma 公司；TGF-β1 購(gòu)自PeproTech 公司；E-Cadherin （E-Cad） 抗體、Fibronectin （FN）抗體、Vimentin （Vim）抗體購(gòu)自proteintech 公司；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific。 IX71熒光倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；CO2孵育箱、 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific 公司；7500 Real-Time PCR 儀購(gòu)自Applied Biosystems公司；半干轉(zhuǎn)儀器購(gòu)自Bio-Rad 公司；發(fā)光檢測(cè)儀購(gòu)自Bio-Rad ChemiDoc 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

A549 細(xì)胞用F-12 培養(yǎng)基（ 含有100U/ml 青霉 素，100mg/L鏈霉素和10%胎牛血清） 于37℃，5% CO2條件下在孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%以上，以0.25% 胰蛋白酶消化，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。取6 孔培養(yǎng)板，每孔加入2.5ml 的5×104細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓15h。 將體外培養(yǎng)A549 細(xì)胞分隨機(jī)2 組：空白組、模型組?？瞻捉M為A549 細(xì)胞+F-12 培養(yǎng)基； 模型組為A549 細(xì)胞+F-12 培養(yǎng)基+10ng/ml TGF-β1。 繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。

1.2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)

將8×103個(gè)A549 細(xì)胞加到96 孔板，24h 后細(xì)胞貼壁，吸出培養(yǎng)液，加入5、10ng/ml 濃度的TGF-β1 為模型組，加入F-12 完全培養(yǎng)液為空白組，并在24h、48h、72h 繼續(xù)培養(yǎng)。 隨后加入10μl MTT，并在培養(yǎng)箱中孵育4h，再加入100μl 三聯(lián)溶解液放培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。 在490nm 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。 空白孔的平均吸光度作為100%，模型孔的吸光度除以正?？椎钠骄舛?，乘以100%，得到每孔的增殖率。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)

TGF-β1 經(jīng)過(guò)24h、48h、72h 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞后，將細(xì)胞放置顯微鏡在60 倍條件下觀察。 每組隨機(jī)分成5 個(gè)樣本，每樣本隨機(jī)拍照5 個(gè)視野，其相片用在細(xì)胞形態(tài)對(duì)比。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

TGF-β1 干預(yù)24h、48h、72h 后，用Trizol 一步法提取總RNA。 測(cè)定RNA 水平，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以cDNA 為模板加入靶基因（Fn，Vim，ECad），參照基因（β-actin）為反應(yīng)體系的基礎(chǔ)，設(shè)定反應(yīng)參數(shù)并擴(kuò)增目標(biāo)基因，樣品的Ct 值與樣品的第一版本的拷貝之間存在線性關(guān)系。其中以βactin，F(xiàn)n，Vim，E-Cad，外顯子序列為模板，Oligo 7.0 為設(shè)計(jì)模板。 引物序列如表1。

1.2.5 Western blot（蛋白印跡法）分析

TGF-β1 處理細(xì)胞24h、48h、72h 的A549 細(xì)胞。 細(xì)胞用適量的0.1%PMSF 裂解，20s 超聲破碎，冰上孵育30min。 高速離心后采集漂浮物質(zhì)并在BCA 模式下測(cè)量。 將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至標(biāo)準(zhǔn)濃度后，取12～15μl 樣品用于SDS-PAGE 電泳，并將半干膜法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1h 后，加入一抗，稀釋比例為1：3000 并在4℃下孵育過(guò)夜。 IgG 抗兔二抗在37℃下孵育1h。 用PBST 沖洗10min×3 次，并使發(fā)光檢測(cè)儀曝光拍照。以β-actin 為內(nèi)參，用Quantity One 系統(tǒng)分析，并對(duì)凝膠條帶的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行E-Cad、FN、Vim半定量分析。

表1 引物序列

1.2.6 免疫熒光法

將細(xì)胞爬片放置孔底，將細(xì)胞種植到6 孔板，分別加入TGF-β1 刺激24h、48h、72h。 移入1 個(gè)干凈的六孔板冷PBS 浸泡<3min。 每個(gè)玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定15min。 用微量移液槍加一抗，稀釋比例1：100，4℃冰箱過(guò)夜。 PBS-Tween洗，3 次×5min。 用微量移液槍加入二抗，稀釋比例1：150，覆蓋均勻平放室溫孵育1h，避光。 PBSTween 洗3 次×5min，將6 孔板倒置顯微鏡在200倍條件下觀察每孔細(xì)胞。每組隨機(jī)選取5 個(gè)樣本、每個(gè)樣本隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照。 應(yīng)用Image J軟件處理圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 TGF-β1 刺激不同時(shí)間對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響

使用Prism5.0 軟件分析組間差異，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，然后應(yīng)用Tukey 法。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)MTT 法在5ng/ml 和10ng/ml 濃度和24h、48h、72h 條件點(diǎn)下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48h、72h 與空白組比較，在5ng/ml TGF-β1 細(xì)胞有增殖作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在10ng/ml TGF-β1 細(xì)胞有明顯增殖作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P<0.01），見(jiàn)圖1。

2.2 TGF-β1 刺激在不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)的變化

據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選10ng/ml 作為T(mén)GF-β1的刺激濃度。 將細(xì)胞放置倒置顯微鏡下，圖2（見(jiàn)封二）示，在24h 與空白組比較，模型組無(wú)明顯變化。在48h 與空白組比較，模型組細(xì)胞有形態(tài)學(xué)改變，部分細(xì)胞從類(lèi)似于橢圓形變?yōu)轭?lèi)似伸長(zhǎng)的紡錘樣的形狀，細(xì)胞圓形度明顯下降。在72h 與空白組比較，模型組細(xì)胞有明顯形態(tài)學(xué)改變，幾乎所有細(xì)胞呈伸長(zhǎng)的紡錘形態(tài)，細(xì)胞圓形度極度降低。

圖2 TGF-β1刺激不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響（×50）

72h時(shí)與空白組比較，模型組細(xì)胞有明顯形態(tài)學(xué)改變，幾乎所有細(xì)胞呈伸長(zhǎng)的紡錘樣的形態(tài)，細(xì)胞圓形度極度降低。

2.3 TGF-β1 誘導(dǎo)EMT 在不同時(shí)間點(diǎn)FN、Vim、E-Cad mRNA 表達(dá)水平

通過(guò)q-PCR 檢測(cè)，圖3 示，在48h 與空白組比較，模型組FN mRNA 表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），E-Cad mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 在72h 與空白組比較，模型組FN mRNA 表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），E-Cad mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4 TGF-β1 誘導(dǎo)EMT 在不同時(shí)間點(diǎn)FN、Vim、E-Cad 熒光表達(dá)水平

圖3 FN、Vim、E-Cad mRNA 表達(dá)水平

通過(guò)免疫熒光法，結(jié)果顯示在48h、72h 與空白組比較，模型組FN、Vim 熒光表達(dá)上調(diào)，E-Cad熒光表達(dá)下調(diào)（圖4，見(jiàn)封二）。

圖4 FN、Vim、E-Cad 熒光表達(dá)水平（×200）

免疫熒光法顯示，在48h、72h時(shí)與空白組比較，模型組FN、Vim 熒光表達(dá)上調(diào)，E-Cad 熒光表達(dá)下調(diào)。

2.5 TGF-β1 誘導(dǎo)EMT 在不同時(shí)間點(diǎn)FN、Vim、E-Cad 蛋白表達(dá)水平

通過(guò)Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示在48h 與空白組比較，模型組FN 蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），E-Cad 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 在72h 與空白組比較，模型組FN、Vim 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），E-Cad 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖5）。

圖5 FN、Vim、E-Cad 蛋白表達(dá)水平

3 討論

EMT 是參與胚胎發(fā)育及許多慢性疾病和纖維化及腫瘤疾病發(fā)展有關(guān)的一種現(xiàn)象。 EMT 的過(guò)程，也稱為“轉(zhuǎn)分化”。 此現(xiàn)象中，細(xì)胞失去上皮特性，包括極化和與特定細(xì)胞的間接處，獲得遷移的能力，允許它們離開(kāi)上皮層并融入周?chē)M織[8～10]。EMT 是指上皮細(xì)胞通過(guò)其間充質(zhì)特性極化的細(xì)胞和分子轉(zhuǎn)換。大量研究表明，這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與人類(lèi)許多癌癥的不良預(yù)后和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。EMT 現(xiàn)象不但促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲的作用以外，而且還顯示賦予腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡和失去凋亡的抗性[11]。TGF-β1 為誘導(dǎo)EMT 發(fā)生的主要因子，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為T(mén)GF-β1 誘導(dǎo)EMT 有兩個(gè)途徑，依賴Smad 信號(hào)通路和非依賴Smad 信號(hào)通路。正常情況下，細(xì)胞外基質(zhì)的TGF-β1 處于無(wú)活性狀態(tài)。在各種刺激因素作用下，TGF-β1 被激活形成二聚體，此二聚體與TGF-β2 型和TGF-β1 型受體相結(jié)合，形成異二聚體，使Smad2、Smad3 磷酸化，磷酸化的Smad2/3 與Smad4 形成復(fù)合體并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，激活轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug 等，致EMT 發(fā)生。 此外，TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 也能激活非Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括MAPK、Akt 等通路。 TGF-β1與受體結(jié)合后激活MAPKK，然后MAPKK 激活MAPK，最終致EMT[12]。

本實(shí)驗(yàn)為了證實(shí)在體外實(shí)驗(yàn)TGF-β1 刺激時(shí)間越長(zhǎng)，則EMT 現(xiàn)象發(fā)生越為明顯。 本研究將A549 細(xì)胞為模型，以TGF-β1 為刺激因子 誘導(dǎo)EMT 發(fā)生，并且使用當(dāng)前的先進(jìn)技術(shù)，從形態(tài)學(xué)和分子學(xué)角度，對(duì)EMT 發(fā)生的時(shí)間和信號(hào)通路進(jìn)行研究。 首先，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果來(lái)看，在48h、72h 與空白組比較，模型組大部分細(xì)胞呈紡錘樣的形狀，細(xì)胞的圓形度極度降低。 提示48h 和72h均為T(mén)GF-β1 促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)變化的時(shí)間，尤其72h 最為顯著。 根據(jù)上述的結(jié)果，以q-PCR、Western blot、免疫熒光技術(shù)，來(lái)觀察TGF-β1 對(duì)肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化不同時(shí)間點(diǎn)基因和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果示在48h 和72h 時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)N mRNA、蛋白及熒光表達(dá)上調(diào)，E-Cad mRNA、蛋白及熒光表達(dá)下調(diào)。 說(shuō)明在這2 個(gè)時(shí)間段TGF-β1 能夠降低上細(xì)胞標(biāo)志物E-Cad，并增加間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物FN、Vim 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT 現(xiàn)象的發(fā)生。 但仔細(xì)觀察結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)，可以看出上皮細(xì)胞標(biāo)志物ECad，在48h 和72h 時(shí)mRNA、蛋白均有同樣程度的下調(diào)。 而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物FN 和Vim，在48h 和72h 時(shí)mRNA、 蛋白有不同程度的上調(diào)，尤其在72h FN 和Vim mRNA、 蛋白表達(dá)上調(diào)更為明顯。提示在早期時(shí)候肺泡上皮細(xì)胞先受損，晚期隨著上皮細(xì)胞的損傷，間質(zhì)細(xì)胞亦出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，最終導(dǎo)致EMT 的發(fā)生。本研究的結(jié)果基本符合臨床上肺纖維化的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征，以特發(fā)性肺纖維化（IPF）為例，初期患者主要表現(xiàn)為干咳少談或沒(méi)有任何癥狀，影像學(xué)表現(xiàn)為雙側(cè)，不對(duì)稱，伴有肺容積縮??； 隨著時(shí)間越長(zhǎng)久到了晚期患者表現(xiàn)為咳嗽、進(jìn)行性呼吸困難、活動(dòng)后明顯，肺部出現(xiàn)網(wǎng)狀影，牽拉性支擴(kuò)、蜂窩影多見(jiàn)，外周及兩肺底分布，新老病灶共存。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以A549 上皮細(xì)胞為模型，從細(xì)胞外形到基因及蛋白表達(dá)，研究在不同時(shí)間段，TGF-β1 誘導(dǎo)EMT 發(fā)生的關(guān)系。 最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)，EMT 發(fā)生與TGF-β1 刺激的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。提示72h 和48h 為為體外實(shí)驗(yàn)EMT 發(fā)生的時(shí)間，但48h 只能影響到上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，對(duì)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)影響不大，其在72h 二者表達(dá)均很明顯。 研究結(jié)果亦符合臨床實(shí)際，EMT 為腫瘤和纖維化疾病發(fā)病的重要機(jī)制，這些疾病發(fā)病大多數(shù)為老年病患，其形成是長(zhǎng)年累月的最終結(jié)果。 本實(shí)驗(yàn)下一步研究可探討某些通路在不同時(shí)間段的基因和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步了解EMT 發(fā)生機(jī)制，從而助于臨床對(duì)腫瘤和纖維化等疾病的預(yù)防和治療。