趙冰兵 ，任 雯 ，周秒依 ，李韓帥 ，劉 亞 ，白琪林

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心，北京100097）

玉米是全球第一大作物，是糧食、飼料、能源化工等行業(yè)的重要作物，其產(chǎn)量直接關(guān)系到國家的糧食安全[1]。1996年，轉(zhuǎn)基因玉米首次獲得商業(yè)化許可進行推廣，此后轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化種植面積逐年上升，到2017年，轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積達到5 970萬hm2，僅次于轉(zhuǎn)基因大豆（9 410萬hm2）。隨著轉(zhuǎn)基因玉米占轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物比例不斷攀升，玉米轉(zhuǎn)基因品種的數(shù)量也越來越多[2]。而玉米轉(zhuǎn)基因檢測作為轉(zhuǎn)基因研究體系中的重要一環(huán)，其重要性不言而喻。轉(zhuǎn)基因玉米成分檢測對于鑒定轉(zhuǎn)基因玉米品種、對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行有效規(guī)范管理具有重要的現(xiàn)實意義[3]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，其配套的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)也層出不窮，除了應(yīng)用最為普遍的常規(guī)PCR方法，根據(jù)PCR原理技術(shù)又發(fā)展出一系列諸如多重PCR、復(fù)合PCR、數(shù)字PCR以及RT-PCK等轉(zhuǎn)基因檢測手段[4-10]。而在玉米轉(zhuǎn)基因檢測過程中使用最為普遍的常規(guī)PCR法檢測中使用CTAB法、SDS法等方法[11-12]提取制備DNA模板不僅是檢測的第1步，也是檢測中耗時耗力最多的一個環(huán)節(jié)。直接PCR技術(shù)的出現(xiàn)無疑是解決這一問題的一大突破。張晉強等[13]利用血液直接PCR法，建立了一種快速檢測豬嗜血支原體感染的方法；羅天寬等[14]采用水稻不同類型葉片作為PCR擴增模板，直接進行PCR反應(yīng)，成功建立一種適用于水稻葉片檢測的直接PCR法；陸紹紅等[15]通過直接PCR法對血液中伊氏錐蟲感染進行了檢測，使該方法可以應(yīng)用于伊氏錐蟲病的早期診斷以及現(xiàn)場調(diào)查；閔現(xiàn)華等[16]研究證明，直接PCR法可以作為一種高特異性、高靈敏度、簡便快捷的方法用于檢測番茄種子攜帶的番茄潰瘍病菌；邢珍娟等[17-18]以轉(zhuǎn)CP4-epsps基因玉米為材料，對直接PCR快速檢測方法在玉米檢測中的應(yīng)用進行了初步探索，而該直接PCR方法在其他玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用并不多見。

本研究以CC-2和2A-5這2種轉(zhuǎn)基因玉米樣品的葉片作為PCR反應(yīng)模板，進行直接PCR反應(yīng)，建立適用于玉米中轉(zhuǎn)基因成分檢測的直接PCR方法，并結(jié)合多重PCR技術(shù)，獲得一套檢測結(jié)果特異性高的直接PCR技術(shù)體系，用于快速篩查轉(zhuǎn)基因玉米。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因樣品材料為CC-2和2A-5；非轉(zhuǎn)基因樣品材料為京科968（對照）。

1.2 試驗試劑

Phire熱啟動II DNA聚合酶及dNTPs，購自Thermo公司；DNA分子量標記（100 bp DNA Marker），購自北京全式金生物科技公司。

1.3 引物設(shè)計

利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0分別對CC-2和2A-5設(shè)計若干對事件特異性引物，根據(jù)玉米基因組序列及結(jié)構(gòu)對設(shè)計的多對引物進行篩選及優(yōu)化，并參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)部關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的相關(guān)法律法規(guī)[19]，最終確定一對用于本試驗的檢測引物（表1）。本試驗采用了葉綠體DNA中的高度保守基因IRB18基因設(shè)計引物作為對照引物[20]。試驗中所用引物均由北京擎科新業(yè)生物公司合成，引物終濃度為10 μmol/L。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米檢測引物

1.4 試驗材料的準備

從2種轉(zhuǎn)基因玉米材料CC-2，2A-5及非轉(zhuǎn)基因玉米材料京科968中挑選籽粒飽滿、無損傷的種子，分別于培養(yǎng)箱內(nèi)浸泡6 h，30℃暗條件下進行發(fā)芽。48h后挑選發(fā)芽整齊一致的種子播種在23cm×16 cm規(guī)格的塑料盆內(nèi)。每盆播4粒種子。每個塑料盆內(nèi)填充1.8 kg壤土、0.7 kg蛭石（1∶1（V/V））及3.0 g的復(fù)合肥（有效含量45%）。

用打孔器于每個樣品植株幼苗葉片上取直徑為0.5 mm的葉片小塊備用；用取下的同一葉片其他部分進行DNA提?。ㄊ褂檬占噭┖刑崛》椒ǎＭ瑫r使用常規(guī)提取DNA模板進行PCR檢測試驗，作為同組樣品葉片直接PCR試驗的陽性對照。

1.5 PCR反應(yīng)體系及條件

單重PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：10 mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，200 μmol/L dNTP each，正反向引物各 0.5 μL，1 U Phire熱啟動II DNA聚合酶0.4 μL，各成分配置完成后，以ddH2O補齊至20 μL體系。將切割好的0.5 mm的葉片小塊直接置于反應(yīng)體系中，最好使葉片懸浮在反應(yīng)體系中，葉片貼壁則會影響PCR反應(yīng)結(jié)果。

單重PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性5 s，62℃退火 5 s，72℃延長20 s，40個循環(huán)；72℃過度延伸1 min。

多重PCR反應(yīng)體系使用降落PCR方法，用以提高產(chǎn)物特異性。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP each，2 種檢測正反向引物各 0.5 μL，1 U Phire熱啟動 II DNA聚合酶 0.6 μL，2%DMSO，去離子水補充到25 μL。將切割好的0.5 mm的葉片小塊直接置于反應(yīng)體系中。

多重PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min；98℃ 變性5 s，65℃ 退火5 s，每循環(huán)降低1℃，72℃延長20 s，20個循環(huán)；72℃過度延伸1 min；98℃變性5 s，52℃退火 5 s，72℃延長20 s，20個循環(huán)；72℃過度延伸1 min。

1.6 PCR擴增產(chǎn)物

取PCR擴增產(chǎn)物各6 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2%，電泳電壓100 V，電泳時間45 min；電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進行拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片直接PCR的對照反應(yīng)

所有材料的葉片樣品都經(jīng)過葉綠體DNA基因IRB18檢測，均可擴增出長度為297 bp的特異性條帶，與IRB18基因條帶預(yù)期大小一致（圖1），且與使用傳統(tǒng)提取DNA模板進行PCR檢測的結(jié)果對比結(jié)果一致。表明此批樣品葉片可通過直接PCR方法進行轉(zhuǎn)基因檢測。

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米事件特異性檢測

由瓊脂糖電泳結(jié)果（圖2～4）可知，CC-2，2A-5這2種轉(zhuǎn)基因材料的葉片通過直接PCR方法均擴增出與預(yù)期條帶大小一致的目的條帶，且目的條帶的特異性符合試驗要求（CC-2為292 bp，2A-5為214 bp）。

2.3 多重PCR檢測結(jié)果

瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示，CC-2和2A-5這2種轉(zhuǎn)基因事件在一次直接葉片PCR反應(yīng)中得到了有效擴增（圖4）。由圖4可知，葉片直接PCR進行多重PCR檢測效果與常規(guī)DNA提取方法效果完全一致。使用待測樣品葉片進行直接PCR方法檢測，特異性強，具有可重復(fù)性，可以作為PCR檢測轉(zhuǎn)基因的新方法得到廣泛應(yīng)用。

3 討論

隨著全球越來越多的轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，對轉(zhuǎn)基因檢測工作提出了更高的要求。因此，一種簡單、快速、高效的檢測方法對于檢測工作至關(guān)重要，也必然是轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。提取DNA耗時耗力，通常提取DNA的步驟所用時間是制約檢測效率和速度的主要環(huán)節(jié)，本研究通過對國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因玉米檢測方面現(xiàn)有方法的大量試驗和比對，選擇IRB18基因作為對照參考基因，將2種轉(zhuǎn)基因玉米事件分別進行PCR事件特異性檢測，建立了一套針對葉片PCR的玉米轉(zhuǎn)基因事件檢測反應(yīng)體系和條件，現(xiàn)利用該方法檢測轉(zhuǎn)基因事件樣品及對照樣品均可擴增出符合IRB18基因大小的目的條帶，分別單獨檢測CC-2及2A-5的電泳圖中目的條帶清晰、特異性強，與國家標準檢測條帶大小一致。表明該方法可實際應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測。

目前，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因作物種類的增加，含有不同轉(zhuǎn)基因成分的混合樣品也在不斷增加，這就為轉(zhuǎn)基因檢測提出了更高的要求。為了進一步提高檢測效率，使用本試驗中建立的葉片PCR方法進行了多重PCR試驗，進一步驗證該檢測方法的有效性及高效性。由試驗結(jié)果可以觀測到，所選的2種轉(zhuǎn)基因玉米使用葉片直接PCR與多重PCR均獲得較為滿意的檢測結(jié)果，擴增條帶大小與預(yù)期一致，并且條帶清晰，特異性高，其中，多重PCR相較于普通PCR來說，具有更高的可靠性與更廣的適應(yīng)性，能夠進一步簡化檢測流程，極大地提高檢測效率。

本研究可為轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測提供一個新的思路和參考。目前，很多實驗室及檢測相關(guān)部門常用的檢測方法是將需要檢測的樣品種子先進行萌發(fā)，然后取幼苗部分作材料進行DNA提取，最后用樣品DNA進行PCR擴增，獲得檢測結(jié)果，而這一系列過程花費的時間較長，應(yīng)用本研究方法在一個較短的時間內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，將大大地縮短檢測周期，提高檢測效率。使用多重降落PCR方法有助于更好地提高特異性。試驗證明，適當?shù)腜CR循環(huán)數(shù)有利于反應(yīng)的順利進行，獲得不錯的PCR結(jié)果。試驗中還發(fā)現(xiàn)，進行40～45個循環(huán)獲得的擴增結(jié)果令人滿意。

但該方法在實際應(yīng)用中還存在一些問題。老葉片及凍干葉片進行直接PCR效率不高，且條帶特異性不強。因此，目前該檢測方法仍需使用嫩葉片。此外，某些基因的轉(zhuǎn)化材料尚未找到可以進行直接PCR的引物。這些問題使該方法目前尚不能廣泛應(yīng)用于大批量檢測及未知樣品檢測，仍需繼續(xù)進行大量的研究工作對該方法的操作及使用進行補充、改進和完善，使其在轉(zhuǎn)基因玉米檢測中發(fā)揮更大的作用。