馬金祥，馬金蘭，馬金華

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,西寧 810016)

骨肉瘤起源于骨間充質(zhì)細(xì)胞，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。其每年發(fā)病率在不同年齡段略有不同：在0～14歲內(nèi)為4.0/百萬(3.5/百萬～4.6/百萬)，在0～19歲內(nèi)為5.0/百萬(4.6/百萬～5.6/百萬)。在兒童易患的癌癥中，骨肉瘤發(fā)病率排在第8位。骨肉瘤發(fā)病率男性高于女性，呈雙峰型分布，在10～14歲時出現(xiàn)第1個高峰，與生長激素激增相關(guān)；在65歲以上人群中出現(xiàn)第2個高峰，與佩吉特氏病相關(guān)。最常見的部位是股骨、脛骨和肱骨。骨肉瘤的5年整體生存率為68%。最佳治療效果是在骨肉瘤轉(zhuǎn)移前手術(shù)完整切除。化療藥物和化療方案對骨肉瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依然至關(guān)重要。骨肉瘤具有發(fā)病率高、耐藥性強(qiáng)及易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，導(dǎo)致其預(yù)后差[1]。盡管近年來，科學(xué)家們確定了幾種分子標(biāo)記物，但敏感性和特異性欠缺。因此，開發(fā)新型藥物對原發(fā)性骨肉瘤的治療至關(guān)重要。

鐮形棘豆(oxytropis falcate)屬于棘豆屬，主要分布在中國西北部，在西藏和內(nèi)蒙古被廣泛用于民間偏方。其全草在中藥中也被廣泛使用，主要用于治療發(fā)熱、流感、扁桃體炎、咽喉炎、急慢性支氣管炎、便血、痢疾等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抑菌、抗氧化、抗炎、止血和抗腫瘤等藥效[2]，有效成分主要包括黃酮類、多酚類、多糖及生物堿等[3]。近年研究顯示鐮形棘豆總黃酮(flavonoids of oxytropis falcate,FOF)具有抗腫瘤效果，但主要集中在對肝癌的治療研究中[4]，對其他腫瘤的作用效果研究少見報道。2016年，李欽[5]發(fā)現(xiàn)FOF可抑制由轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)引起的腎纖維化，其主要是通過抑制TGF-1β/Smads通路實(shí)現(xiàn)的。該通路在大部分轉(zhuǎn)移性腫瘤中被激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化[6]。因此，推測FOF可能會通過抑制TGF-1β/Smads通路抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。

為探索FOF是否可通過TGF-β/Smad3通路抑制骨肉瘤細(xì)胞EMT及其分子機(jī)制，為FOF首次應(yīng)用于抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移提供理論支持，本研選取骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞系作為研究對象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 MG63細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自北京四季青生物科技有限公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液、超敏型ECL檢測試劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液及蛋白免疫印跡(Western blot)轉(zhuǎn)膜液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、p-Smad3、磷酸化轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅱ(p-TGF-βRⅡ)單克隆抗體購自英國Abcam公司，Transwell小室購自Millipore公司，TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒均購自日本Takara公司，TGF-β1 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司。引物信息：Twist正向引物5′-CTT GCC AAT CAG CCA CTG AC-3′;反向引物5′-CCA GTT TGA TCC CAG CGT TT-3′；Snail正引物 5′-CCT TCA GGC CAC CTT CTT TG-3′;反向引物 5′-TCC AGT AAC CAC CCT GCT GA-3′;GAPDH正向引物:5′-CCG AGG GCC CAC TA A AGG-3′；反向引物:5′-GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC AA-3′,以上引物由日本Takara公司合成。FOF由甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MG63細(xì)胞用含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至80%～90%融合度時傳代。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞，并用含有10% FBS的高糖型DMEM培養(yǎng)基配制成1×105/mL濃度的單細(xì)胞懸液。于每孔100 μL加入到96孔板中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待貼壁后，分別加入0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的FOF，其中0 μg/mL組加入相同體積的二甲基亞砜(DMSO)作為空白組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)20 μL，培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO室溫避光溶解MTT，于490 nm處在酶標(biāo)儀上檢測吸光度(OD)值。為排除藥物的誘導(dǎo)凋亡作用所引起的對以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，同時保證藥物的作用效果，本研究選取48 h作為處理時間、≤半數(shù)致死濃度(IC50)的兩個梯度濃度(25.0 μg/mL組、50.0 μg/mL組)作為處理濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在超凈工作臺中，將Transwell小室放入24孔板中，備用。取對數(shù)生長期細(xì)胞用0、25%胰酶消化并用無血清培養(yǎng)基配制成1.5×105/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔400 μL加入到Transwell小室上室中，并在下室中加入600 μL含有20%血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個平行對照。并分別加入0 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL的FOF，其中0 μg/mL組加入相同體積的DMSO作為空白組，放入37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，將Transwell小室取出，放入-20 ℃無水甲醇固定5 min，棉簽輕輕拭去上室中未遷移細(xì)胞后，0.25%結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗去未染色結(jié)晶紫，顯微鏡下觀察拍照，并隨機(jī)選取6個視野計數(shù)細(xì)胞，統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.4ELISA實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞，胰酶消化并用含有10% FBS的高糖型DMEM培養(yǎng)基配制成1×104/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔1 mL種植于6孔板中，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合后，加入不同濃度藥物，每組設(shè)6個平行對照，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心后，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5qPCR實(shí)驗(yàn) MG63細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底融合度達(dá)到80%后，加入不同濃度藥物處理48 h后，用TRIzol法提取總RNA，步驟如下：PBS洗滌MG63細(xì)胞，加入TRIzol于冰上裂解5 min，收集裂解液，13 000 r/min離心，收集上清液，加入氯仿，靜置離心，吸取上清液加入異丙醇，靜置離心，棄上清液，75%乙醇清洗沉淀，離心棄上清液，保留沉淀干燥，用焦碳酸二乙酸(DEPC)水溶解。然后按照日本Takara反應(yīng)試劑盒依次經(jīng)過去除基因組DNA反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃、30 s，40循環(huán)數(shù)。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞，PBS洗滌后，加入RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞，待細(xì)胞裂解后收集于離心管中，繼續(xù)裂解30 min，13 000 r/min離心，收集上清液，測定蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液，煮沸5 min，充分變性，-20 ℃保存?zhèn)溆?。制膠：10%分離膠+5%濃縮膠；按蛋白濃度確定上樣量；然后經(jīng)過電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜，PBS洗滌，二抗室溫孵育1.5 h，PBS洗滌，ECL發(fā)光液顯色，X射線顯影，拍照，用Image pro plus軟件分析光密度值。

2 結(jié) 果

2.1FOF對MG63細(xì)胞增殖的影響 在相同時間下，隨著FOF處理濃度的升高，MG63細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，其中處理24、48、72 h的IC50分別為80.84、44.90、31.36 μg/mL；在相同濃度下，隨著處理時間的增長，MG63細(xì)胞增殖抑制率也逐漸升高。見圖1。

圖1 FOF對MG63細(xì)胞增殖的影響

A：空白組；B:25.0 μg/mL組；C:50.0 μg/mL組；D:定量分析；a：P<0.05，與空白組比較

圖2 FOF對MG63細(xì)胞遷移的影響

2.2FOF對MG63細(xì)胞遷移的影響 隨著FOF濃度的增大，遷移細(xì)胞逐漸減少，與空白組比較，25.0 μg/mL組和50.0 μg/mL組遷移細(xì)胞數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

2.3FOF對MG63細(xì)胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響 隨著FOF濃度的增大，E-cadherin表達(dá)逐漸增多，Vimentin表達(dá)逐漸減少，見圖3。

圖3 FOF對MG63細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白水平的影響

2.4FOF對MG63細(xì)胞Snail1、Twist mRNA表達(dá)水平的影響 隨著FOF濃度的增大，Snail1、Twist mRNA表達(dá)水平逐漸減少，經(jīng)統(tǒng)計，與空白組比較，25.0 μg/mL組和50.0 μg/mL組中Snail1、Twist mRNA表達(dá)變化差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5FOF對MG63細(xì)胞上清液中TGF-β1水平的影響 隨著FOF濃度的增大，MG63細(xì)胞上清中TGF-β1水平逐漸減少。經(jīng)統(tǒng)計，與空白組[(10.35±1.64)ng/mL]比較，25.0 μg/mL組[(6.98±0.91)ng/mL]和50.0 μg/mL組[(3.70±0.54)ng/mL]中TGF-β1水平變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

a:P<0.05，與空白組同種mRNA比較

圖4 FOF對MG63細(xì)胞Snail1、Twist mRNA表達(dá)水平的影響

圖5 FOF對MG63細(xì)胞中p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白的影響

2.6FOF對MG63細(xì)胞p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白表達(dá)的影響 隨著FOF濃度的增大，p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白水平逐漸減少，見圖5。

3 討 論

近年，由鐮形棘豆中提取的黃酮類物質(zhì)逐步被各研究者發(fā)掘出具有抗腫瘤效果。楊光明等[7]發(fā)現(xiàn)FOF可通過調(diào)控Bcl-2/Bax的比率誘導(dǎo)肝癌SMMC-7細(xì)胞系凋亡。陳曉紅等[8]進(jìn)一步對FOF引起SMMC-7721細(xì)胞凋亡的途徑進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)FOF可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Cyt C蛋白表達(dá)水平升高，并伴隨線粒體膜電位發(fā)生變化，揭示FOF可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。但是其對骨肉瘤的抗癌效果及對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響并未見報道。因此，本研究選取MG63細(xì)胞為研究對象探索FOF抗骨腫瘤效果及對EMT的影響。通過MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOF以時間和濃度依賴的方式抑制MG63細(xì)胞增殖，提示FOF具有一定的抗MG63細(xì)胞增殖的能力?？紤]到時間過長或濃度過高，細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，而時間過短或濃度太低，對細(xì)胞代謝無影響，因此本研究選取48 h時的最接近IC50的左右兩個FOF濃度處理MG細(xì)胞。

EMT能夠使上皮細(xì)胞獲得類似于間質(zhì)細(xì)胞的特征，使其具有較高的轉(zhuǎn)移能力。在大部分腫瘤獲得轉(zhuǎn)移能力的過程中，伴隨EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及通路發(fā)生異常[9]。在EMT轉(zhuǎn)化過程中，直接相關(guān)的蛋白有E-cadherin、N-cadherin、Vimentin，其中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)FOF處理后，MG63細(xì)胞遷移能力下降，E-cadherin蛋白表達(dá)上升，Vimentin蛋白表達(dá)下降。提示FOF可逆轉(zhuǎn)MG63細(xì)胞EMT，從而抑制MG63細(xì)胞遷移。研究發(fā)現(xiàn)[10]轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Twist通過特異性識別E-box堿基序列下調(diào)E-cadherin mRNA表達(dá)，上調(diào)Vimentin mRNA表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞EMT。本研究通過qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOF具有降低MG63細(xì)胞中Snail1、Twist mRNA的能力。以上提示FOF可通過抑制MG63細(xì)胞中Snail1、Twist mRNA表達(dá)，降低相應(yīng)蛋白水平，逆轉(zhuǎn)EMT，達(dá)到抑制MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果。

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smads通路調(diào)控Snail1、Twist表達(dá)[11]。在多數(shù)腫瘤當(dāng)中異常激活的TGF-β1/Smads通路通過誘導(dǎo)Snail1過表達(dá)介導(dǎo)EMT[12]。TGF-β1與細(xì)胞表面TGF受體結(jié)合導(dǎo)致TGF-βRⅡ磷酸化激活，并進(jìn)一步磷酸化激活Smad3，p-Smad3進(jìn)入細(xì)胞核啟動Snail1、Twist表達(dá)?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)很多藥物均可通過抑制TGF-β1/Smads通路逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT[12]。本研究發(fā)現(xiàn)FOF可降低MG63細(xì)胞上清液中TGF-β1的水平及MG63細(xì)胞中p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白水平。提示FOF可抑制MG63細(xì)胞分泌TGF-β1的能力，進(jìn)而抑制Smad3、TGF- βRⅡ磷酸化水平。

綜上可知FOF對MG63細(xì)胞增殖具有抑制作用，并可通過抑制TGF-β1/Smads過度激活，逆轉(zhuǎn)MG63細(xì)胞EMT，從而降低MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)移。由于與EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)的信號通路還涉及其他多條通路，F(xiàn)OF是否還通過其他途徑逆轉(zhuǎn)EMT轉(zhuǎn)化，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。