廖奕嬌，陳奕君，何日明，劉新輝，楊曙東△

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院腎病科，廣東深圳 518033；2.廣東省深圳市中醫(yī)院腎病科 518033)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是我國(guó)終末期腎臟病(ESRD)的第二位原發(fā)病，并且其患病率和發(fā)病率均呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。DN患者因高糖血癥而引起腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張及細(xì)胞外基質(zhì)增生，使腎小球高濾過(guò)、產(chǎn)生蛋白尿，最終由慢性腎功能不全進(jìn)展為ESRD[2]。足細(xì)胞是腎小球臟層上皮細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)的損傷及功能的改變都會(huì)影響腎小球?yàn)V過(guò)膜的通透性，是評(píng)估腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性的重要生物標(biāo)志物[3]。高糖對(duì)足細(xì)胞的損傷所導(dǎo)致的濾過(guò)膜屏障破壞是DN產(chǎn)生蛋白尿的主要原因[4]。podocin作為足細(xì)胞裂孔隔膜的主要蛋白分子，是足細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，在維持足細(xì)胞的正常形態(tài)和功能及蛋白尿發(fā)生中起重要作用[5]。

A:未分化細(xì)胞；B:對(duì)照組；C:60 mmol/L組

圖1 足細(xì)胞形態(tài)變化(×100)

近年來(lái)的研究表明，線粒體在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。線粒體是一個(gè)動(dòng)態(tài)細(xì)胞器，其形態(tài)的維持依靠線粒體分裂和融合機(jī)制。線粒體分裂和融合可增加細(xì)胞應(yīng)激抵抗力，分裂/融合的異常與疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。然而，目前有關(guān)高糖刺激對(duì)足細(xì)胞線粒體分裂/融合影響的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本研究擬通過(guò)觀察不同濃度葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)的人足細(xì)胞線粒體分裂/融合相關(guān)蛋白的調(diào)控，以探討高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞與材料

1.1.1永生化人足細(xì)胞AB8/13(英國(guó)布里斯托大學(xué)Moin A.SALEEM教授饋贈(zèng))。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒溶液(ITS)、雙抗及胰酶(美國(guó)Gibco公司)?？贵w：足突蛋白(podocin)、線粒體融合蛋白1(mitofusion 1，Mfn1)及Mfn2(英國(guó)Abcam公司)；線粒體分裂因子(mitochondrial fission factor，Mff)、線粒體動(dòng)力蛋白(MiD49，美國(guó)Proteintech公司)；視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1，OPA1,美國(guó)BD Biosciences公司)；二抗(CST公司)。儀器：超凈工作臺(tái)(新加坡ESCO公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；全自動(dòng)凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)ChemiDocTMMP Imaging System公司)、垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1足細(xì)胞培養(yǎng) 足細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后用含10%FBS、1% ITS及1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基于33 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行增殖。每1～2天換液1次。細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90% 時(shí)用0.25% 胰蛋白酶[含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)]溶液消化、傳代。將一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱用含5% FBS及1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化10 d后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組：普通RPMI-1640培養(yǎng)基；高糖刺激組的葡萄糖濃度分別為30(30 mmol/L組)、45(45 mmol/L組)、60 mmol/L(60 mmol/L組)。刺激時(shí)間為48 h。

1.2.3蛋白免疫印跡(Western blot) 細(xì)胞分組刺激后吸除培養(yǎng)液，以預(yù)冷的0.01 mol/L PBS洗滌2次。加入1×細(xì)胞裂解液80～100 μL/皿并均勻覆蓋，置于冰上裂解10～15 min。用細(xì)胞刮仔細(xì)刮下細(xì)胞蛋白并吸入EP管內(nèi)，離心(4 ℃，12 000×g，10 min)后將上清液轉(zhuǎn)入另一EP管；電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉60 min；孵育一抗、二抗，曝光顯影，圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1足細(xì)胞形態(tài)變化 與未分化細(xì)胞相比，經(jīng)過(guò)10 d分化的對(duì)照組足細(xì)胞可見足突生成(箭頭所示)。而經(jīng)60 mmol/L高糖刺激48 h后足突廣泛減少甚至消失，見圖1。

A:Western blot圖；B:Western blot分析圖；1:對(duì)照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對(duì)照組比較

圖2 各組細(xì)胞podocin表達(dá)

A:Western blot圖；B、C:Western blot分析圖；1:對(duì)照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對(duì)照組比較

圖3 各組細(xì)胞線粒體分裂相關(guān)蛋白表達(dá)

A:Western blot圖；B、C、D:Western blot分析圖；1:對(duì)照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對(duì)照組比較

圖4 各組細(xì)胞線粒體融合相關(guān)蛋白表達(dá)

2.2足細(xì)胞標(biāo)志蛋白podocin表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果顯示，高糖刺激可呈濃度依賴性下調(diào)podocin表達(dá)，其中60 mmol/L組足細(xì)胞podocin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，為正常對(duì)照組0.63倍，見圖2。

2.3線粒體分裂相關(guān)蛋白表達(dá) 高糖刺激可呈濃度依賴性增加線粒體分裂相關(guān)蛋白MiD49及Mff的表達(dá)。其中，60 mmol/L組與對(duì)照組比較，MiD49表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，60 mmol/L組Mff表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，表達(dá)水平為對(duì)照組的1.33倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.4線粒體融合相關(guān)蛋白表達(dá) 各濃度的高糖刺激對(duì)足細(xì)胞線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1的表達(dá)均有一定下調(diào)作用。其中，30、45、60 mmol/L組均可顯著下調(diào)Mfn1表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4A、B。45 mmol/L組與60 mmol/L組Mfn2表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4A、C。60 mmol/L組OPA1表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4A、D。

3 討 論

DN表現(xiàn)的持續(xù)蛋白尿與足細(xì)胞裂孔隔膜密切相關(guān)，裂孔隔膜的完整性是腎小球?yàn)V過(guò)機(jī)械屏障的關(guān)鍵[7]。podocin是分布于裂孔膜的跨膜蛋白，起到細(xì)胞骨架連接橋梁作用，是防止清蛋白濾出的關(guān)鍵分子蛋白，但裂孔膜分子易受損害，一旦發(fā)生突變則會(huì)破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性，產(chǎn)生大量蛋白尿[8]。國(guó)內(nèi)外已有不少研究表明高糖環(huán)境下足細(xì)胞的增殖降低，出現(xiàn)podocin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)的現(xiàn)象[9-11]。

線粒體的分裂與融合對(duì)其正常功能的發(fā)揮具有非常重要的作用，線粒體通過(guò)不斷活躍的分裂/融合可穩(wěn)定線粒體的形態(tài)及分布[12]。線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2及OPA1等，其分裂蛋白則有MiD49、Mff等。Mfn1和Mfn2是線粒體融合的關(guān)鍵介導(dǎo)蛋白，Mfn1主要在融合的前期促進(jìn)線粒體間的彼此結(jié)合，Mfn2則主要在線粒體融合反應(yīng)的后期起作用[13]。OPA1位于線粒體內(nèi)膜上，具有促進(jìn)線粒體融合的功能，可使嵴連接處于關(guān)閉狀態(tài)，以維持嵴的形態(tài)[14-15]。MiD49、Mff可以募集動(dòng)力相關(guān)蛋白1促進(jìn)線粒體裂變，且MiD49在Mff缺失的情況下，仍可推動(dòng)分裂的進(jìn)行[16]。本研究用不同濃度葡萄糖對(duì)足細(xì)胞作用48 h，與對(duì)照組比較，60 mmol/L的高糖刺激可引起足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知podocin表達(dá)明顯下調(diào)。同時(shí)，由Western blot結(jié)果可知60 mmol/L高糖可上調(diào)線粒體分裂相關(guān)蛋白、下調(diào)線粒體融合相關(guān)蛋白，表明線粒體形態(tài)調(diào)控在高糖的作用下發(fā)生了明顯的變化。

綜上所述，高糖可能通過(guò)增加線粒體分裂、減少線粒體融合誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷及形態(tài)異常。該研究從線粒體形態(tài)調(diào)控的角度闡明了高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制及可能靶點(diǎn)，為下一步治療藥物的篩選奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。