李寶華，戈海澤，劉樹業(yè)

(天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 300170)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種全球常見的惡性腫瘤，也是致死率排名第3的腫瘤，不良預(yù)后和高發(fā)病率使它成為世界關(guān)注的惡性腫瘤之一[1-2]。目前，臨床上對于早期肝癌的治療方式主要有手術(shù)切除和原位肝移植這兩種，但這些療法存在很大的局限性，只對部分患者適用，而且也未能達(dá)到預(yù)期的療效[3-4]。因此，臨床上需要治療肝癌的新策略。

肝癌的發(fā)病機(jī)制是一個極其復(fù)雜的過程；研究表明一些致病因子可促使慢性肝炎進(jìn)一步惡化，并伴隨有基因表達(dá)水平和表觀遺傳修飾的改變，這很可能是導(dǎo)致抑癌基因沉默和原癌基因激活的主要原因；在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中某些微RNAs(microRNA,miRNAs)的表達(dá)水平也變得異常[5-6]。目前，很多研究想通過基因療法來得到可靠的癌癥檢測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)；但是，這些分子標(biāo)志物由于很多原因在臨床上并沒用被廣泛應(yīng)用[7]；因此，這些不足更促使醫(yī)學(xué)者們想進(jìn)一步地了解肝癌的發(fā)病機(jī)制。

miRNA是一類廣泛存在于動植物中的單鏈非編碼的小RNA，由內(nèi)源基因編碼，長度在18～22個核苷酸，其主要作用于基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究表明，在腫瘤相關(guān)的疾病中，miRNA對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等起重要的調(diào)控作用[8]，miRNA的表達(dá)差異造成了腫瘤的發(fā)展變化。因此，miRNA在癌癥研究方面具有非常重要的意義[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-214[11]和miRNA-491-5p[12]等表達(dá)的失調(diào)與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。miRNA可靶向作用特定的抑癌或致癌基因，通過改變它們的表達(dá)量來調(diào)控肝癌的進(jìn)程[10]。本試驗(yàn)主要探討miR-193a在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，以及其對肝癌細(xì)胞Huh7的增殖、遷移、侵襲能力及KRAS表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 本研究中的肝癌組織和其配對的癌旁組織均取自本院檢驗(yàn)科。所有標(biāo)本的獲取都經(jīng)過患者的知情同意，并且得到本院醫(yī)學(xué)倫理道德委員會的批準(zhǔn)。術(shù)后立即將標(biāo)本置于液氮罐內(nèi)備用。人肝癌細(xì)胞Huh7購自上海奧陸生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購于美國HyClone公司；胰酶購于日本Taraka公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于美國Invitrogen 公司；CCK-8購于上海碧云天生物有限公司；實(shí)時熒光定量 PCR試劑盒購于瑞士Roche公司；蛋白裂解液RIPA購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；KRAS和GAPDH抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Huh7細(xì)胞用含有10%胎牛血清，100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別按照6孔板5×104/孔或者96孔板5×103/孔的量鋪板，18～24 h后按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染，分為miR-NC和miR-193 mimics組，按既定的時間做相關(guān)的試驗(yàn)。

1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h后測定450 nm處吸光度(OD)值，細(xì)胞活性按照CCK-8試劑盒說明書計(jì)算并作圖。

1.2.3集落形成試驗(yàn) Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收集并計(jì)數(shù)，按照500/孔的數(shù)量接種在12孔板內(nèi)，每3天更換培養(yǎng)基1次，大約2周后處理細(xì)胞。先用1×PBS清洗1遍，再用結(jié)晶紫染料染色并計(jì)數(shù)。

1.2.4細(xì)胞遷移試驗(yàn) Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將miR-NC和miR-193 mimics組細(xì)胞用無血清的DMEM重懸，各取200 μL加到Transwell小室中，每孔5×104個Huh7細(xì)胞，下室加600 μL含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔，48 h后用4%的多聚甲醛室溫固定并用0.1% 結(jié)晶紫染色，拭去未遷移的細(xì)胞后拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.5細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 用無血清DMEM以1∶8的比例稀釋Matrigel，用預(yù)冷的槍頭吸100 μL加到Transwell 小室中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱放置1 h使之聚合。后續(xù)試驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移試驗(yàn)。

1.2.6實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-193a mRNA和KRAS mRNA的表達(dá)水平 患者組織加液氮研磨后用TRIzol法提取總RNA。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)過48 h后用TRIzol法提取總RNA。用分光光度計(jì)檢測總RNA的純度。合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR分析，試驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。試驗(yàn)中所需的引物序列如下：miR-193a 正向引物5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTG CAC TGG ATA CGA CTC ATC TC-3′；反向引物：5′-TGC GGT GGG UCA AAG CGG GC-3′；U6正向引物：5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAGC-3′；U6反向引物：5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′；U6-RT：5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；Oligo-dT：5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3′；KRAS正向引物5′-GGG TGT TGA TGA TGC CTT CT-3′；KRAS反向引物5′-TAC TGG CAC TTA GAG GAA-3′。

1.2.7Western blot檢測KRAS蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞收集后用1×PBS洗1遍，加入RIPA裂解液重懸后冰上裂解30 min，中間再混勻1次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度定量試劑盒完成濃度檢測。變性后的蛋白用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗(1∶1 000)4 ℃敷過夜，1×TBST洗3遍，每遍10 min；室溫敷二抗(1∶1 000)1 h，1×TBST洗3遍，每遍10 min。最后滴加發(fā)光液并在暗室曝光。

2 結(jié) 果

2.1miR-193a在腫瘤組織中表達(dá)水平 在GEO數(shù)據(jù)庫中分析miR-193a的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的癌帝組織比較，miR-193a在肝癌組織中低表達(dá)(圖1A)。在TCGA數(shù)據(jù)庫分析異常表達(dá)的miR-193a患者的生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在miR-193a低表達(dá)組(n=573)和高表達(dá)組(n=418)中，miR-193a高表達(dá)組的個體存活率有所延長(圖1B)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，與相應(yīng)的癌旁組織比較，miR-193a在肝癌組織中是低表達(dá)的(圖1C)。本研究對21對肝癌患者的肝癌組織和癌旁組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，有19例患者的肝癌組織中miR-193a的表達(dá)量均低于癌旁組織(圖1D)。這些結(jié)果表明，miR-193a在肝癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織低。

A：GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果；B：miR-193a的表達(dá)對患者個體生存時間的影響；C：TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果；D：RT-qPCR分析肝癌組織和癌旁組織中miR-193a的表達(dá)水平；a:P<0.05,與癌旁組織比較

圖1 miR-193a在腫瘤組織中的表達(dá)

A：CCK-8試驗(yàn)；B：集落形成試驗(yàn)；C：EdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)；a：P<0.05，b：P<0.01,與miR-NC組比較

圖2 miR-193a對不同組Huh7細(xì)胞增殖的影響

2.2miR-193a對Huh7細(xì)胞增殖能力的影響 Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-193a mimics后，CCK-8試驗(yàn)表明，miR-193a mimics組的細(xì)胞活性明顯低于miR-NC組(圖2A)。集落形成試驗(yàn)探討miR-193a對Huh7細(xì)胞集落形成能力的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-193a mimics組Huh7細(xì)胞的集落形成能力較miR-NC組受到了明顯的抑制(圖2B)。EdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組比較，miR-193a mimics組Huh7細(xì)胞增殖能力明顯受抑制(圖2C)。上述結(jié)果表明miR-193a會降低Huh7細(xì)胞的活性和集落形成能力。

2.3miR-193a對Huh7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-193a mimics組中Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力都低于miR-NC組,見圖3。表明高表達(dá)miR-193a抑制了Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.4miR-193a直接靶定并下調(diào)KRAS 為了進(jìn)一步研究miR-193a作用于Huh7細(xì)胞可能相關(guān)的分子機(jī)制，筆者采用TargetScan human7.1、miRNA.org和miRDB等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析顯示，KRAS可能是miR-193a的一個候選靶基因(圖4A)。采用RT-PCR和Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miR-193a mimics組KRAS在mRNA和蛋白水平都低于miR-NC組(圖4B、C)。這表明miR-193a抑制了KRAS的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖等特性。

A：Transwell試驗(yàn)檢測miR-193a對Huh7細(xì)胞遷移能力的影響；B：Transwell試驗(yàn)檢測miR-193a對Huh7細(xì)胞侵襲能力的影響；a：P<0.05，b：P<0.01，與miR-NC組比較

圖3 miR-193a對不同組Huh7細(xì)胞遷移和侵襲的影響

A：生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-193a可能的靶點(diǎn)；B：miR-193a對KRAS mRNA水平的影響；C：miR-193a對KRAS 蛋白水平的影響；a：P<0.05，b：P<0.01，與miR-NC組比較

圖4 miR-193a對KRAS表達(dá)的影響

3 討 論

隨著對miRNA在不同腫瘤或相關(guān)疾病中的研究不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA的差異表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，miRNA可能具有抑癌或促癌的作用。例如，miR-144和miR-122-3p分別通過靶向RUNX1和FOXO，使卵巢癌細(xì)胞OC和肺癌細(xì)胞A549的增殖等特性受到嚴(yán)重抑制[13-14]，而miR-1468和miR-451在不同的腫瘤中卻起到促癌作用[15-16]。說明miRNA在將來可能會作為癌癥進(jìn)程中臨床檢測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)[17]。

很多研究表明，miR-193a可能是1種抑癌的miRNA，與癌細(xì)胞的增殖、分化和遷移密切相關(guān)[18-19]。已有研究表明，miR-193a在腫瘤中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且腫瘤細(xì)胞的增殖及集落形成能力也被miR-193a所抑制[20]。miR-193a隊(duì)具有抑癌作用以外，也有報道稱，在人類胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中miR-193a的表達(dá)水平有所升高，證明它可能在不同的組織中也有促癌作用[21]。因此，研究miR-193a的表達(dá)水平及作用是必要的。

本研究探索了miR-193a對肝癌的作用及相關(guān)的機(jī)制。試驗(yàn)表明與癌旁組織比較，miR-193a在肝癌組織中的表達(dá)顯著降低；通過轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-193a mimics，發(fā)現(xiàn)Huh7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯被miR-193a表達(dá)的升高所抑制。這表明miR-193a起到了抑制肝癌發(fā)展的作用。

為了更進(jìn)一步的探討miR-193a在肝癌發(fā)展過程中的作用，筆者用生物信息學(xué)方法預(yù)測了miR-193a的下游靶點(diǎn)為KRAS，RT-PCR和Western blot兩種試驗(yàn)結(jié)果都表明過表達(dá)miR-193a后降低了KRAS mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

綜上所述，本研究證明miR-193a在肝癌中的表達(dá)水平有明顯的降低，進(jìn)而發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，而這一作用可能是由miR-193a直接靶向KRAS引起的。