宋 航，陳 霞，楊 艷，姜曉芳，馮 靜

(中國(guó)人民解放軍第三二四醫(yī)院,重慶 400020)

嚴(yán)重感染、有毒氣體吸入、休克等均可導(dǎo)致急性肺損傷，組織學(xué)上可表現(xiàn)為不同程度的肺水腫和肺不張等[1]。現(xiàn)臨床治療手段有限，預(yù)后差。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植急性肺損傷模型的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)取得了較大成功[2]。前期課題組也證實(shí)了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)小鼠模型的治療作用，但是目前治療機(jī)制不明。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)MSCs治療成功的關(guān)鍵在于肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell，AEC)的修復(fù)[3]。因此探索MSCs修復(fù)AEC損傷的主要作用部位意義重大。多項(xiàng)研究表明AEC線粒體功能異常在ALI中起著關(guān)鍵作用[4]。但是目前MSCs對(duì)ALI患者AEC線粒體功能的影響，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究選擇A549細(xì)胞作為AEC的代表，希望通過(guò)本研究探明hUC-MSC修復(fù)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的ALI細(xì)胞模型中，hUC-MSC對(duì)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞素A549細(xì)胞線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 hUC-MSCs為課題組前期由人臍帶組織成功分離獲得，A549細(xì)胞株購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑 DMEM/F12、澳洲胎牛血清(美國(guó)Gibco)，二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma-Aldrich)，增強(qiáng)型CCK-8試劑盒、增強(qiáng)型腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、細(xì)胞線粒體分離試劑盒、Western blot制膠試劑盒、脫脂奶粉(杭州碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔多克隆線粒體融合相關(guān)蛋白(Mfn1)抗體、兔多克隆線粒體呼吸相關(guān)蛋白(Miro1)抗體(英國(guó)Abcam公司)，兔多克隆線粒體移動(dòng)基因蛋白(NRF1)抗體(北京博奧森公司)，TBS緩沖液(武漢博士德生物制品公司)，無(wú)水甲醇(重慶川東化工有限公司)。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)，電子天平(Storious公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器公司)，倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2方法

1.2.1LPS誘導(dǎo)ALI模型的建立 取A549細(xì)胞5×106/mL接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，DEME培養(yǎng)液中加入10 μg/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h,建立ALI細(xì)胞模型。

1.2.2A549和hUC-MSCs直接共培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 取hUC-MSCs懸液500 μL，細(xì)胞密度5×106/mL直接加入已加入LPS的A549培養(yǎng)瓶中，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。實(shí)驗(yàn)分為4組：A549+PBS、A549+LPS、A549+MSCs、A549+MSCs+LPS。

1.2.3流式細(xì)胞分選術(shù) 無(wú)菌條件下采用流式細(xì)胞分選術(shù)，將混合共培養(yǎng)A549和hUC-MSCs相互分離。上機(jī)分選時(shí)將共培養(yǎng)的細(xì)胞按體積大小明顯分為兩群，分選出體積小的細(xì)胞群。再利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記，分選出其中EGFP陰性表達(dá)的A549，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，證實(shí)分選出的細(xì)胞為EGFP陰性，并且呈現(xiàn)出上皮細(xì)胞特征性的大小均一的短梭形狀。分選出的A549用于線粒體提取、免疫熒光標(biāo)記、功能測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞線粒體熒光探針染色 加入Mito-Tracker Green染色工作液，與細(xì)胞37 ℃共孵育15～45 min。然后去除染色工作液，加入37 ℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5線粒體提取 首先收集A549細(xì)胞并洗滌細(xì)胞，通過(guò)預(yù)處理后勻漿，并對(duì)勻漿效果進(jìn)行鑒定。細(xì)胞勻漿1 000×g離心10 min后，小心把上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中繼續(xù)3 500×g離心10 min，小心去除上清液。沉淀即為分離得到的細(xì)胞線粒體。在分離得到的線粒體樣品中可以加入150～200 μL線粒體儲(chǔ)存液，重懸線粒體。

1.2.6細(xì)胞ATP及ROS測(cè)定

1.2.6.1細(xì)胞ATP測(cè)定 吸除培養(yǎng)液裂解細(xì)胞。裂解后4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清液，用于后續(xù)的測(cè)定。每孔加入100 μL ATP檢測(cè)工作液及20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻后，用液閃儀測(cè)定RLU值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的水平。

1.2.6.2細(xì)胞ROS測(cè)定 收集細(xì)胞后裝載探針,稀釋2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)使終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為1×106/mL，繼續(xù)孵育20 min。收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.2.7線粒體膜電位測(cè)定 配制JC-1染色工作液后設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液(1×)稀釋5倍。加入0.1 mL總量為10～100 μg純化的線粒體。用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.8Western blot方法測(cè)定線粒體功能因子(Mfn1、Drp1、Miro1)表達(dá)水平 制膠后加樣及電泳，然后轉(zhuǎn)膜封閉，一抗孵育后二抗孵育，確?？贵w均勻孵育在聚偏氯乙烯(PVDF)膜上。并行顯影及圖像分析，以GAPDH 作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，用ImageQuant TL對(duì)圖像進(jìn)行灰度值半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1分選后A549行熒光探針染色標(biāo)記 分選后A549細(xì)胞在熒光顯微鏡下滿視野可見明亮的強(qiáng)熒光染色，證實(shí)提取后的細(xì)胞線粒體活性可，見圖1。

圖1 分選后AEC線粒體熒光探針染色

2.2混合培養(yǎng)后A549細(xì)胞的ATP及ROS變化 A549+PBS組與A549+LPS組比較，ATP與ROS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；A549+LPS組與A549+MSCs+LPS組比較，ATP與ROS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，而A549+MSCs+LPS組與A549+PBS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。可以看出，LPS刺激下A549細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組ATP下降，ROS升高；而與hUC-MSCs混合培養(yǎng)后，細(xì)胞ATP升高，ROS下降，見圖2。

①：A549+MSCs+LPS組；②：A549+LPS組；③：A549+PBS組；④：A549+MSCs組;a:P<0.05,b:P<0.01

圖2 LPS誘導(dǎo)下A549的ATP及ROS水平

2.3混合培養(yǎng)后A549線粒體膜電位變化 A549+PBS組線粒體膜電位與A549+LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A549+MSCs+LPS組與A549+PBS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；A549+LPS組與A549+MSCs+LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。證實(shí)LPS刺激下AEC線粒體膜電位顯著下降，hUC-MSCs可有效提高AEC線粒體膜電位，見圖3。

①：A549+MSCs+LPS組；②：A549+LPS組；③：A549+PBS組；④：A549+MSCs組;a:P<0.01

圖3 LPS誘導(dǎo)下A549的線粒體膜電位

2.4Western blot測(cè)定混合培養(yǎng)后AEC線粒體功能因子的變化 與A549+PBS組比較，LPS+A549組Mfn1、Miro1、NRF1明顯降低(P<0.01)。A549+LPS組Mfn1、NRF1、Miro1表達(dá)水平顯著低于A549+MSCs+LPS組(P<0.01)。A549+PBS組與A549+MSCs組比較Mfn1、Miro1蛋白表達(dá)水平顯著減低(P<0.01)，而NRF1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:Western blot結(jié)果；B：Mfn1定量分析；C：NRF1定量分析；D:Miro1定量分析；①：A549+MSCs+LPS組；②：A549+LPS組；③：A549+PBS組；④：A549+MSCs組

圖4 LPS刺激下AEC 線粒體相關(guān)功能蛋白變化

3 討 論

近年來(lái)有關(guān)ALI致病機(jī)制的研究及治療手段都取得較大進(jìn)步，但是其發(fā)病率及病死率仍然很高。ALI主要表現(xiàn)為肺血?dú)饨粨Q屏障破壞，伴有體內(nèi)炎癥因子和趨化因子水平明顯升高[5]。AEC作為肺泡壁的重要組成成分，主要構(gòu)筑肺血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障，在ALI進(jìn)程中起著穩(wěn)定肺泡結(jié)構(gòu)，減輕全身炎性反應(yīng)，維持凝血/纖溶平衡，促進(jìn)肺泡內(nèi)液體的清除及免疫調(diào)節(jié)的作用。因此AEC的完整性與ALI的預(yù)后和生存密切相關(guān)[6]。而線粒體做為一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜的重要細(xì)胞器，在細(xì)胞能量代謝和信號(hào)通路傳導(dǎo)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)AEC在ALI進(jìn)程中線粒體發(fā)生酶活性改變，鈣超載及通透性轉(zhuǎn)換等，隨之線粒體融合/分裂、移動(dòng)、能量代謝等功能受到嚴(yán)重影響，加重AEC的損傷[8]。由此可見，ALI觸發(fā)的炎性反應(yīng)與AEC線粒體功能完整性明確相關(guān)，修復(fù)AEC線粒體的功能將成為ALI治療的新目標(biāo)[9]。

截止目前，針對(duì)AEC修復(fù)的臨床治療策略非常有限，主要集中在MSCs移植治療[10]。MSCs治療肺損傷的療效及安全性已得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)可[11]。多項(xiàng)研究認(rèn)為MSCs治療ALI的機(jī)制主要為3個(gè)方面：抗炎作用、旁分泌作用及免疫調(diào)節(jié)作用[12]。但是MSCs對(duì)AEC線粒體功能的影響尚不明確。

研究已證實(shí)線粒體通過(guò)融合和分裂實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，融合和分裂間的平衡與氧自由基產(chǎn)生量有關(guān)[13]。介導(dǎo)機(jī)體線粒體融合的蛋白主要包括Mfnl、Mfn2，其中以Mfn1最常見，位于線粒體外膜[14]。核呼吸因子NRF1的表達(dá)受到PRARr-1共激活因子-1α(PGC-1α)的誘導(dǎo)，而且PGC-1α和NRF1二者結(jié)合能夠直接調(diào)控DNA編碼過(guò)程線粒體氧化磷酸化復(fù)合物的表達(dá)[15]。另Miro1通過(guò)支持膜突出和病灶黏附性的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)線粒體在前緣位置，以提供局部能量生成促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)。故認(rèn)為Miro1做為線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白，可調(diào)控線粒體移動(dòng)促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)：A549細(xì)胞與hUC-MSCs直接混合培養(yǎng)后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)A549成功分選，分選后A549細(xì)胞線粒體染色呈明亮的強(qiáng)熒光。hUC-MSCs可以調(diào)控A549線粒體的能量代謝功能，保護(hù)LPS刺激下A549線粒體膜電位，可明顯提高A549線粒體Miro1水平，而且此作用與LPS刺激無(wú)關(guān),且hUC-MSCs對(duì)A549線粒體損傷的修復(fù)是多方面的，包括移動(dòng)、融合分裂、呼吸鏈功能。

本研究證實(shí)了hUC-MSCs可能通過(guò)調(diào)控AEC的線粒體功能，修復(fù)LPS誘導(dǎo)的AEC損傷，但其調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究探索。