李丹 俞云 李圓君 惠鑫 王昊 韓麗 王晶 趙百孝

摘要：目的? 探討艾煙可吸入物（PM10）對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響及PI3K/Akt信號(hào)通路在其中的作用。方法? 采用24 h內(nèi)新生SD大鼠乳鼠前額葉皮質(zhì)及海馬組織體外培養(yǎng)原代神經(jīng)細(xì)胞，H2O2誘導(dǎo)建立氧化損傷細(xì)胞模型;隨機(jī)分為空白組、氧化損傷組、氧化損傷+PM10組、氧化損傷+PM10+抑制劑組、PM10組。采用TUNEL和DAPI染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡形態(tài);MTT法及Western blot分別檢測(cè)細(xì)胞存活率及目的蛋白表達(dá)，并用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002驗(yàn)證作用通路。結(jié)果? MTT檢測(cè)顯示，200 μmol/L H2O2能降低神經(jīng)細(xì)胞50%存活率（P<0.001），0.1、0.5 ng/mL艾煙PM10能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡（P<0.001）;TUNEL和DAPI染色顯示，0.5 μg/mL艾煙PM10能拮抗H2O2誘導(dǎo)氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化（P<0.001）;Western blot檢測(cè)顯示，H2O2及LY294002能降低p-Akt、Bcl-2的表達(dá)（P<0.05，P<0.001），上調(diào)active-Caspase-3的表達(dá)（P<0.01，P<0.001），而艾煙PM10作用相反（P<0.01，P<0.001）。結(jié)論? 艾煙PM10能減少神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的凋亡，其機(jī)制可能是激活PI3K/Akt信號(hào)通路并調(diào)控下游凋亡蛋白Bcl-2、active-Caspase-3的表達(dá)，拮抗細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：艾煙PM10;過氧化氫;細(xì)胞凋亡;PI3K/Akt信號(hào)通路;大鼠

中圖分類號(hào)：R245? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）04-0042-05

氧化應(yīng)激是指活性氧簇（ROS）的生成和清除失平衡狀態(tài)，這一病理過程與許多疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。艾煙可吸入物（PM10）是傳統(tǒng)中醫(yī)灸法的燃燒產(chǎn)物，含有多種生物活性成分[1-2]，具有抗氧化應(yīng)激、抗自由基、殺菌等作用[3-8]。近年研究表明，艾煙能激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而產(chǎn)生作用[9]。相關(guān)研究表明，激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制H2O2引起的氧化損傷，從而延緩疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)建立原代神經(jīng)元氧化損傷模型，予艾煙PM10預(yù)處理，觀察其對(duì)H2O2介導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，并通過加入PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷抑制劑LY294002闡明其作用機(jī)制。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動(dòng)物

新生1日齡SD大鼠乳鼠3只，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。所有乳鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度60%～80%，保持通風(fēng)，定時(shí)換氣，每日光照12 h。

1.2? 主要試劑與儀器

MTT、DAPI、多聚賴氨酸溶液（美國(guó)Sigma公司），TUNEL試劑盒（美國(guó)CST公司），MEM EARLES（美國(guó)Invitrogen公司），谷氨酰胺、B27（美國(guó)Invitrogen公司），阿糖胞苷（美國(guó)Sigma公司），胎牛血清、馬血清、胰蛋白酶（美國(guó)Invitrogen公司），Bcl-2抗體、active-Caspace-3抗體（美國(guó)Invitrogen公司），p-Akt和T-Akt抗體（美國(guó)Invitrogen公司），LY294002（美國(guó)CST公司）。CKX41-倒置顯微鏡（日本Olympus公司），5417R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendodf公司），熒光/吸收光酶標(biāo)儀（美國(guó)Therm公司），Tanon4200化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 艾煙可吸入物制備

實(shí)驗(yàn)用艾條為南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司三年蘄艾條。將艾絨置于玻璃箱中點(diǎn)燃，將Mini VolTM PM10便攜式采樣器置于玻璃箱中采集煙霧，吸附在劍橋?yàn)V片上。采樣前后劍橋?yàn)V片的質(zhì)量差即為采集的艾燃燒產(chǎn)物的質(zhì)量。用DMSO溶解PM10制成終濃度為100 mg/mL的艾燃燒生成物原溶液，除菌過濾并避光存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱備用。每次實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMSO濃度≤1%）。

2.2? 分組和造模

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為空白對(duì)照組、氧化損傷組、氧化損傷+PM10組、氧化損傷+抑制劑+PM10組、PM10組。原代神經(jīng)元培養(yǎng)：從新生SD大鼠分離海馬及前額葉腦組織，0.25%胰蛋白酶消化、離心細(xì)胞并重新懸浮。將細(xì)胞鋪覆在用多聚賴氨酸涂覆的板上，培養(yǎng)2～4 h，2%馬血清、2%B27和1%GlutaMAX MEM EARLES繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后10 nmol/L阿糖胞苷處理細(xì)胞抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。用前細(xì)胞培養(yǎng)7～8 d。

2.3? 干預(yù)

培養(yǎng)7 d后，不同濃度PM10（自制）加入到原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基24 h，或用200 μmol/L H2O2處理神經(jīng)元24 h構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。在研究藥物作用通路的實(shí)驗(yàn)中，用Akt抑制劑LY294002（終濃度10 μmol/L）提前處理細(xì)胞30 min。再用PM10處理細(xì)胞。

2.4? 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1? MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

給藥后繼續(xù)孵育細(xì)胞24 h，之后每孔加入MTT（終濃度0.5 ng/mL），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光繼續(xù)孵育24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO液，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞存活率[細(xì)胞吸光度-空白孔吸光度）÷（對(duì)照組細(xì)胞吸光度-空白孔吸光度）×100%]。

2.4.2? TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

4%PFA和4%蔗糖在PBS中固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌后，加入0.1%Triton X-100和0.1%檸檬酸鈉的PBS冰育2 min。用PBS洗滌2次后加適量TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌后加適量DAPI，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。TUNEL染色細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核為綠色熒光，DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。細(xì)胞凋亡百分率通過計(jì)算比值來確定。TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)在1個(gè)計(jì)數(shù)中共100個(gè)細(xì)胞。取5個(gè)計(jì)數(shù)的平均值為神經(jīng)元細(xì)胞死亡的百分比。

2.4.3? Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

各組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥后繼續(xù)孵育細(xì)胞24 h，洗滌后裂解細(xì)胞，冰上反應(yīng)30 min，離心，取上清液。BCA法測(cè)定各組蛋自濃度，將每個(gè)樣品蛋白濃度調(diào)成一致，10%SDS-PAGE分離蛋自質(zhì)，PVDF轉(zhuǎn)膜后奶粉封閉30 min，一抗（1∶1000）孵育過夜（4 ℃），TBST洗3～5次，二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，TBST漂洗，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，兩組間進(jìn)行獨(dú)立本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

4? 結(jié)果

4.1? MTT檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，氧化損傷組細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.001），表明造模成功。加入0.1、0.5 ng/mL PM10能提高氧化損傷細(xì)胞的存活率，與氧化損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.001）。另外，相同濃度PM10組較空白對(duì)照組細(xì)胞存活率略高（P<0.05），表現(xiàn)出一定濃度PM10對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。提示PM10對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。結(jié)果見圖1。

4.2? TUNEL和DAPI染色結(jié)果

相近細(xì)胞數(shù)目情況下，氧化損傷組較空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.01）。氧化損傷+PM10組較氧化損傷組細(xì)胞凋亡率下降（P<0.001）。提示PM10對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡損傷有抑制作用。結(jié)果見圖2、圖3。

4.3? Western blot檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，氧化損傷組細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)量明顯下降（P<0.001）;與氧化損傷組比較，氧化損傷+PM10組神經(jīng)細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.01）;加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，與氧化損傷+PM10組比較，PM10這種拮抗作用消失（P<0.05），提示PI3K/Akt信號(hào)通路參與了PM10拮抗H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果見圖4。

與氧化損傷組比較，氧化損傷+PM10組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯增加（P<0.001），而加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，與氧化損傷+0.5 ng/mL PM10組比較，PM10拮抗作用消失（P<0.05），提示PI3K/Akt信號(hào)通路及其調(diào)控的凋亡蛋白Bcl-2參與了PM10拮抗H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果見圖5。

與氧化損傷組比較，氧化損傷+PM10組神經(jīng)細(xì)胞active-Caspase-3表達(dá)量下調(diào)（P<0.01），而加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，與氧化損傷+0.5 ng/mLPM10組比較，PM10拮抗作用明顯減弱（P<0.01），提示PI3K/Akt信號(hào)通路及其調(diào)控的凋亡蛋白active-Caspase-3參與了PM10拮抗H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果見圖6。

5? 討論

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷。生理?xiàng)l件下的ROS物質(zhì)能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，抗氧化系統(tǒng)與其抗衡，當(dāng)平衡狀態(tài)被破壞，自由基等大量聚集，引起人體脂質(zhì)過氧化及蛋白質(zhì)等變性，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變[11]。

H2O2是一種易于獲得的重要ROS，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，極易透過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過FENTON反應(yīng)形成高活性的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，已成為研究各類細(xì)胞氧化損傷的重要工具[12]。故本實(shí)驗(yàn)選擇H2O2處理神經(jīng)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型，并通過MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率來驗(yàn)證造模是否成功。

氧化應(yīng)激是許多疾病的誘發(fā)因素和病理過程[12]，與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，是阿爾茨海默病的病因假說。因此，緩解細(xì)胞組織的氧化應(yīng)激損傷無疑成為一種有效防治這類疾病的潛在方案。目前許多在體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)艾煙能減緩阿爾茨海默病氧化應(yīng)激損傷，從而防治其發(fā)生發(fā)展[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，采用MTT、DAPI和TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞損傷情況，Western blot驗(yàn)證作用通路相關(guān)蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示終濃度為200 μmol/L H2O2處理組細(xì)胞存活率為50%左右，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.001）。0.5 ng/mL PM10預(yù)先干預(yù)氧化損傷細(xì)胞，可顯著減少細(xì)胞凋亡，與氧化損傷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），與Western blot結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PM10作用于氧化損傷細(xì)胞，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，增加p-Akt、Bcl-2下游蛋白表達(dá)，并抑制active-Caspase3的表達(dá)（P<0.01，P<0.001），當(dāng)加入Akt通路阻斷劑LY294002后，各相關(guān)蛋白結(jié)果相反，證實(shí)了其作為通路之一為PI3K/Akt信號(hào)通路的假設(shè)。

艾灸已被用于治療各種類型的疾病，但仍無足夠的證據(jù)直接證明其有效性。本實(shí)驗(yàn)首次證明了PM10對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化誘導(dǎo)凋亡的保護(hù)作用，特別是對(duì)阿爾茨海默病相關(guān)細(xì)胞的影響，結(jié)果可作為證明艾灸有效性的證據(jù)之一，其中艾煙也被驗(yàn)證成為艾灸起效的關(guān)鍵因素，同時(shí)為治療阿爾茨海默病提供潛在防治方案，而PM10起效濃度、混合物的純化及相關(guān)研究仍需進(jìn)一步深入完善。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHOU C L， FENG X M， WANG J H， et al. Research advance on moxa smoke[J]. Journal of Acupuncture and Tuina Science，2011，9（2）：67-72.

[2] YU M， JIN R， ZHAO B， et al. SPME-GC-MS determination of phenol in the smoke of moxa[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2012，32（10）：1870-1873.

[3] XU H， ZHAO B， CUI Y， et al. Effects of moxa smoke on monoamine neurotransmitters in SAMP8 mice[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：178067.

[4] HUANG J， LIN M Y， ZHAO B， et al. PM10 mass concentration and oxidative capacity of moxa smoke.[J]. Qjm，2015，108（9）：705-710.

[5] HITOSUGI N， OHNO R， HATSUKARI I， et al. Diverse biological activity of Moxa extract and smoke[J]. Vivo，2001，15（3）：249-254.

[6] SAKAGAMI H， MATSUMOTO H， SATOH K， et al. Cytotoxicity and radical modulating activity of Moxa smoke[J]. Vivo，2005，19（2）：391-397.

[7] MATSUMOTO H， SHIMADA J， NAGASAKA H， et al. Inhibition by Moxa smoke of NO production and iNOS expression in mouse macrophage- like cells Raw 264.7[J]. Vivo，2005，19（2）：471.

[8] MENG X N， HUAN-FANG X U， CUI Y X. Effect of moxa products after burning on SOD， MDA and GSH-Px in the brain of senescence accelerated mice[J]. Global Traditional Chinese Medicine，2011， 4（6）：413-415.

[9] 劉耀萌，劉鈞天，黃暢，等.不同艾灸因素對(duì)阿爾茨海默小鼠PI3K/AKT通路與皮質(zhì)β淀粉樣蛋白沉淀的影響[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1395-1400.

[10] 蘇倩.Akt信號(hào)通路通過激活TFEB而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2017.

[11] 朱若岑，蔣維維，譚柱良，等.動(dòng)物體內(nèi)活性氧、氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡以及抗氧化劑研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2015，34（3）：21-25.

[12] 塔依爾·吐爾松，買吾拉尼江·依孜布拉，努爾買買提·艾買提.神經(jīng)退行性疾病的抗氧化研究進(jìn)展[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（6）：725-729.

[13] 劉鈞天，黃暢，劉耀萌，等.艾灸各因素對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦中DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化應(yīng)激的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015， 40（5）：1375-1379.

[14] 蔡虹，鄔繼紅，趙百孝，等.艾煙冷凝物對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383活性和吞噬功能的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（7）：501- 504.

[15] 黃暢，崔瑩雪，劉鈞天，等.艾灸及艾煙對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠血清MDA、SOD水平的影響[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1407-1409，1413.

（收稿日期：2018-11-14）

（修回日期：2018-12-01;編輯：華強(qiáng)）