王雪 方靖漪 楊靜 修成奎 雷燕

摘要：目的? 觀察人參三七川芎提取物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬流的影響，探討其延緩高糖高脂誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。方法? 采用40 mmol/L葡萄糖和100 μmol/L棕櫚酸鈉造模，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、衰老模型組和中藥組（200 mg/L），干預(yù)48 h。采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老程度;Western blot檢測(cè)細(xì)胞p16、p21、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）和p62蛋白表達(dá);免疫熒光檢測(cè)自噬流變化。結(jié)果? 與空白對(duì)照組比較，衰老模型組細(xì)胞增殖能力和LC3B-Ⅱ表達(dá)降低，β-半乳糖苷酶藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量和p16、p21、p62蛋白表達(dá)增加，并存在自噬流阻滯;與衰老模型組比較，中藥組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)， LC3B-Ⅱ表達(dá)升高，β-半乳糖苷酶藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量減少，p16、p21和p62表達(dá)降低，自噬流暢通。結(jié)論? 人參三七川芎提取物可延緩高糖高脂引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，其機(jī)制可能與增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：人參三七川芎提取物;血管內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞衰老;自噬

中圖分類號(hào)：R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）04-0052-05

2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）目前已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一[1]，其中大血管并發(fā)癥在其各種并發(fā)癥中約占75%，是T2DM患者致殘致死的主要原因[2]。研究表明，血管內(nèi)皮功能紊亂是T2DM大血管并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老在內(nèi)皮功能紊亂過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。細(xì)胞自噬是一種不同于細(xì)胞凋亡的程序性死亡，可將細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器、生物大分子等結(jié)構(gòu)通過(guò)溶酶體降解，實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)及維持穩(wěn)態(tài)，自噬缺陷與癌癥、神經(jīng)退行性變、炎癥和代謝性疾病密切相關(guān)[5]。機(jī)體衰老過(guò)程中自噬活性逐漸衰減，在復(fù)制性和誘導(dǎo)性衰老的細(xì)胞中，通過(guò)不同途徑適當(dāng)上調(diào)自噬具有一定延緩細(xì)胞衰老的作用[6-8]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血中藥人參、三七、川芎能調(diào)節(jié)復(fù)制性衰老的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平[9]，但在高糖高脂誘導(dǎo)的衰老大血管內(nèi)皮細(xì)胞中是否也有同樣的調(diào)節(jié)作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以高糖高脂誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老為模型，觀察人參三七川芎提取物對(duì)細(xì)胞自噬的干預(yù)作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 藥物

人參、三七、川芎合劑凍干粉，北京因科瑞斯醫(yī)藥科技公司制備提供。藥物為道地藥材，人參產(chǎn)自吉林，三七產(chǎn)自云南，川芎產(chǎn)自四川，按2∶3∶4比例破碎成粗粉，乙醇回收提取，過(guò)濾后棄藥渣，醇提液回收至無(wú)醇味濃縮液，繼續(xù)濃縮至稠膏狀，再經(jīng)干燥至干膏，最終每1 g凍干粉相當(dāng)于原藥材4.286 g，使用時(shí)以DPBS配制成10 g/L的貯存液，以0.22 μm濾器過(guò)濾分裝，置于-20 ℃冰箱保存。依據(jù)藥典對(duì)人參三七川芎提取物中指標(biāo)性成分阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1進(jìn)行HPLC分析[10]。

1.2? 細(xì)胞

人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC），美國(guó)Sciencell公司，并提供細(xì)胞鑒定書。

1.3? 試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、青霉素/鏈霉素溶液、胰酶消化液、細(xì)胞凍存液，美國(guó)Sciencell公司，批號(hào)分別為1001、0025、1052、0503、

0103、0133;CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)LG615;細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C0602;p21兔單克隆抗體，p16兔單克隆抗體，LC3B兔單克隆抗體、p62小鼠單克隆抗體，英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab109199、ab51243、ab192890、ab56416;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/山羊抗小鼠IgG（H+L），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ZB-2301、ZB-2305;巴弗羅霉素，美國(guó)MCE公司，批號(hào)88899-55-2;自噬腺病毒載體系統(tǒng)Ad-mRFP- GFP-LC3，漢恒生物科技（上海）有限公司;D-葡萄糖、棕櫚酸鈉美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為SLBR0902V、SLBV2022;無(wú)脂肪酸BSA（d-BSA），北京索萊寶公司，批號(hào)1206F052。棕櫚酸鈉溶于PBS（95 ℃助溶）配成20 mmol/L溶液，將d-BSA按質(zhì)量/體積溶于DPBS（55 ℃助溶）配成20%d-BSA溶液，將棕櫚酸鈉趁熱加入到等體積的d-BSA中，配成10 mmol/L棕櫚酸鈉（含10%d-BSA）貯存液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? 儀器

AE2000型倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），F(xiàn)orma 370型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），Synergy H1型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司），F(xiàn)V1000型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），Mini-PROTEAN Tetra Cell型電泳槽系統(tǒng)，PowerPac universal power supply型通用電泳儀電源，Trans-blot sp cell型半干轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)

HAECs培養(yǎng)于含5%胎牛血清、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、青霉素（100 U/L）/鏈霉素（100 mg/L）的完全培養(yǎng)基，于飽和5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，至細(xì)胞密度為80%～90%，按照1∶2或1∶3傳代培養(yǎng)。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用40 mmol/L D-葡萄糖聯(lián)合100 μmol/L棕櫚酸鈉誘導(dǎo)HAEC細(xì)胞衰老[11]。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、葡萄糖/棕櫚酸誘導(dǎo)的衰老模型組和人參三七川芎提取物干預(yù)的中藥組。

2.2? CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

細(xì)胞5×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，每組進(jìn)行相應(yīng)的處理，藥物作用指定時(shí)間后，將孔板中原液體吸出，向每孔內(nèi)加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋成含10%CCK-8試劑液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～3 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

2.3? 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色

待測(cè)細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，DPBS洗滌1次，每孔加250 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，吸除細(xì)胞固定液，DPBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加250 μL染色工作液，置于無(wú)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量占視野內(nèi)總細(xì)胞量的比例。

2.4? Ad-mRFP-GFP-LC3檢測(cè)自噬流

將狀態(tài)良好的HAECs接種于激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，貼壁24 h后取Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒（病毒滴度為1×107 PFU/mL）在冰上溶解，使用完全培養(yǎng)基按感染復(fù)數(shù)（MOI）=300稀釋，處理4 h后換成新鮮完全培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)48 h后置于熒光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成情況[12]。

2.5? Western blot檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ、p16、p21及p62蛋白表達(dá)

按RIPA蛋白抽提試劑說(shuō)明提取各組總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白含量后調(diào)整蛋白濃度，加5×loading buffer，99 ℃變性10 min;8%～12%SDS- PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶2000稀釋一抗，4 ℃過(guò)夜;TBST清洗3次×5 min，1∶3000稀釋二抗后室溫孵育1 h;TBST清洗3次×5 min，ECL顯示目的條帶。采用Image Lab圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，并以β-actin為內(nèi)參照。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，多組樣本采用方差分析，若方差齊用LSD法進(jìn)行兩兩比較;若方差不齊則用Dunnett's法分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 人參三七川芎提取物中主要成分含量

經(jīng)HPLC檢測(cè)，人參三七川芎提取物中5種主要成分含量見(jiàn)表1。

4.2? 人參三七川芎提取物對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

與空白對(duì)照組比較，高糖高脂干預(yù)48 h可明顯抑制HAECs的增殖;與衰老模型組比較，25～200 mg/L人參三七川芎提取物可明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力，并呈濃度依賴性。但隨著提取物濃度的進(jìn)一步增加，細(xì)胞的增殖能力下降，其中800、1000 mg/L劑量組對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制作用。由此確定中藥最佳干預(yù)劑量為200 mg/L，后續(xù)中藥組濃度選用該劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.3? 人參三七川芎提取物對(duì)細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色的影響

衰老模型組β-半乳糖苷酶藍(lán)染比例較空白對(duì)照組明顯增加（P<0.05）;200 mg/L人參三七川芎提取物處理后β-半乳糖苷酶藍(lán)染陽(yáng)性比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

空白對(duì)照組 衰老模型組 中藥組

4.4? 人參三七川芎提取物對(duì)細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p16、p21的影響

與空白對(duì)照組比較，衰老模型組HAECs p16、p21蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與衰老模型組比較，中藥組HAECs p16、p21蛋白表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

4.5? 人參三七川芎提取物對(duì)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ、p62的影響

與空白對(duì)照組比較，衰老模型組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)降低，p62表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與衰老模型組比較，中藥組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)明顯升高，p62顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

4.6? 人參三七川芎提取物對(duì)細(xì)胞自噬流的影響

將感染mRFP-GFP-LC3雙熒光標(biāo)記腺病毒細(xì)胞進(jìn)行分組刺激，mRFP（紅色熒光）用于標(biāo)記及追蹤LC3蛋白，溶酶體內(nèi)部環(huán)境為酸性，當(dāng)自噬小體與溶酶體融合，對(duì)酸性環(huán)境敏感的GFP（綠色熒光）淬滅。因此，紅綠熒光Merge后，GFP+RFP+為黃色斑點(diǎn)，即為自噬體，GFP-RFP+為紅色斑點(diǎn)，即自噬溶酶體，紅/黃色斑點(diǎn)數(shù)目多少，可清晰判斷出自噬流的強(qiáng)弱及自噬流通暢與否。與空白對(duì)照組比較，衰老模型組黃斑點(diǎn)和紅斑點(diǎn)數(shù)量均減少，表明自噬雖增強(qiáng)，而自噬流不通暢;與衰老模型組比較，人參三七川芎提取物干預(yù)均可明顯增加黃、紅斑點(diǎn)的數(shù)量，尤其是紅色斑點(diǎn)，表明自噬流通暢。結(jié)果見(jiàn)圖5。

5? 討論

自噬是細(xì)胞內(nèi)一種“自食”現(xiàn)象，細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損蛋白質(zhì)、衰老或損傷的細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而保證細(xì)胞能量代謝和新舊細(xì)胞器更迭的順利進(jìn)行[13]。自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)能敏感反映自噬狀態(tài)，當(dāng)自噬小體形成時(shí)，胞漿型蛋白LC3Ⅰ經(jīng)酶解轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3Ⅱ，并被募集定位在自噬體膜上，其水平在一定程度上反映了自噬體數(shù)量和自噬程度。自噬標(biāo)記蛋白p62是多泛素化結(jié)合蛋白，自噬發(fā)生時(shí)p62作為自噬底物蛋白，參與自噬的過(guò)程并在自噬溶酶體中降解，因此，p62蛋白水平與自噬活性成反比，可反映自噬反應(yīng)的強(qiáng)弱[14]。

細(xì)胞自噬與細(xì)胞衰老關(guān)系密切。在衰老過(guò)程中，細(xì)胞可通過(guò)啟動(dòng)自噬，清除受損的生物大分子和功能異常的線粒體等，避免損傷的累積，維持細(xì)胞形態(tài)正常和功能的穩(wěn)定，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[15-16]。但糖尿病患者長(zhǎng)期處于糖脂代謝紊亂狀態(tài)，高糖和高脂環(huán)境通過(guò)抑制ULK1磷酸化、自噬小體形成和溶酶體降解等環(huán)節(jié)，下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平[17-18]，這可能是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入衰老期，造成血管內(nèi)皮完整性喪失和功能紊亂，促進(jìn)血管并發(fā)癥形成的機(jī)制之一[19-20]。

中醫(yī)理論認(rèn)為，氣血是構(gòu)成人體的最基本物質(zhì)，“以奉生身，莫貴于此”，是臟腑經(jīng)絡(luò)等組織器官進(jìn)行生理活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而氣虛血瘀是人體衰老的主要病機(jī)。人參、三七、川芎三藥聯(lián)用有益氣活血、通脈活絡(luò)、延年益壽的功效。本研究采用人參三七川芎提取物干預(yù)高糖高脂處理的HAEC后，發(fā)現(xiàn)人參三七川芎提取物可促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少β-半乳糖苷酶藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量，并降低p16和p21表達(dá)水平，表明人參三七川芎提取物能有效延緩高糖高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞自噬機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，中藥組既可增加LC3B-Ⅱ表達(dá)，也可降低p62水平，表明人參三七川芎提取物能增強(qiáng)衰老內(nèi)皮細(xì)胞的自噬活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。自噬是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，即“自噬流”，細(xì)胞內(nèi)自噬體的增加既可能由于自噬小體形成的增加，也可能由于自噬小體降解的減少[21]。為明確人參三七川芎提取物作用于整個(gè)“自噬流”的環(huán)節(jié)，本研究利用mRFP-GFP-LC3雙熒光標(biāo)記腺病毒作為研究工具，發(fā)現(xiàn)在高糖高脂誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞中，自噬流阻滯于下游自噬溶酶體的降解，表明其自噬活性的增強(qiáng)源于自噬流不通暢;而人參三七川芎提取物干預(yù)可明顯增加黃、紅斑點(diǎn)的數(shù)量，尤其是紅色斑點(diǎn)，表明可促進(jìn)自噬流通暢，中藥組自噬活性增強(qiáng)是通過(guò)促進(jìn)自噬小體的形成階段從而促進(jìn)整個(gè)細(xì)胞“自噬流”的順利進(jìn)行。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)人參三七川芎提取物能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬延緩高糖高脂引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，可為減少糖尿病大血管并發(fā)癥提供一定的借鑒和參考。然而，人參三七川芎提取物通過(guò)哪些具體分子信號(hào)通路增強(qiáng)自噬而延緩細(xì)胞衰老、其間內(nèi)在聯(lián)系是什么、如何保證自噬的平衡狀態(tài)既可誘導(dǎo)又不至于過(guò)度等，這些問(wèn)題在本研究中尚未涉及，需要今后進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2018-10-28）

（修回日期：2019-02-14;編輯：華強(qiáng)）