宗勇　劉瀟檸　金婷婷　孫向榮　欒曉　高勝利　郭菲菲

【摘要】 目的：觀察下丘腦外側(cè)核（LHA）-中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）Orexin-A通路對(duì)大鼠胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)和胃排空的影響。方法：大鼠經(jīng)VTA給予Orexin-A，采用單細(xì)胞外放電記錄方法，觀察VTA內(nèi)胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動(dòng);酚紅定量法測定大鼠胃排空，并觀察電刺激下丘腦外側(cè)核后，VTA內(nèi)Orexin-A反應(yīng)性胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)及大鼠胃排空的變化。結(jié)果：電生理記錄到58個(gè)胃牽張敏感VTA神經(jīng)元（GD），胃擴(kuò)張后呈現(xiàn)興奮效應(yīng)（GD-E）41個(gè)，呈現(xiàn)抑制效應(yīng)（GD-I）17個(gè)。VTA微量注射Orexin-A，41個(gè)GD-E中，68.29%的神經(jīng)元放電頻率顯著升高（P<0.05），而17個(gè)GD-I中，70.59%的神經(jīng)元放電頻率顯著增加（P<0.05）。VTA預(yù)先注射Orexin1型受體拮抗劑SB-334867，則Orexin-A對(duì)胃牽張敏感神經(jīng)元的作用被完全阻斷（P>0.05）。電刺激LHA，在VTA記錄到31個(gè)Orexin-A反應(yīng)性GD-E神經(jīng)元，其中有70.97%神經(jīng)元進(jìn)一步呈現(xiàn)興奮效應(yīng)（P<0.05）;在VTA記錄到的17個(gè)Orexin-A反應(yīng)性GD-I神經(jīng)元，其中有64.71%神經(jīng)元放電頻率顯著升高（P<0.05）。SB-334867預(yù)處理VTA可抑制電刺激LHA的作用（P<0.05）。胃排空研究結(jié)果顯示，VTA內(nèi)微量注射Orexin-A和電刺激LHA，大鼠胃排空均顯著增加（P<0.05），VTA預(yù)先微量注射SB-334867，可阻斷該效應(yīng)（P<0.05）。結(jié)論：下丘腦LHA-VTA存在Orexin-A功能通路，該通路可能參與胃功能的調(diào)控。

【關(guān)鍵詞】 Orexin-A; 下丘腦外側(cè)核-中腦腹側(cè)被蓋區(qū)通路; 胃牽張敏感神經(jīng)元; 胃排空

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.26.002 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2019）26-000-04

Regulation of LHA-VTA Orexin-A Pathway on Discharge Activity of Gastric Distension Responsive Neurons and Gastric Emptying in Rats/ZONG Yong，LIU Xiaoning，JIN Tingting，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（26）：-6

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Orexin-A pathway from lateral hypothalamic nucleus（LHA） to ventral tegmental area（VTA） on the discharge activity of gastric distension（GD） responsive neurons and gastric emptying in rats.Method：Extracellular discharges of single unit neuron was used to observe the discharge activity of GD-responsive neurons in VTA.Phenol red quantitative method was used to measure the gastric emptying in rats.The changes of the discharge activity of GD-responsive neurons in VTA and the gastric emptying in rats were observed after VTA Orexin-A administration or LHA electrical stimulation.

Result：Electrophysiological study showed that 58 GD were recorded in the VTA，of which 41 showed excitatory effects（GD-E） and 17 showed inhibitory effects（GD-I）.Out of the 41 GD-E neurons，the discharge frequency of 68.29% was significantly increased（P<0.05）.Out of GD-I neurons，the discharge frequency of 70.59% was significantly rised（P<0.05）.After preadministration of Orexin-A receptor antagonist SB334867 into VTA，the effect of Orexin-A on GD sensitive neurons was completely blocked（P>0.05）.31 Orexin-A reactive GD-E neurons in VTA were recorded after electrical stimulation of LHA，of which 70.97% neurons showed further excitatory effects（P<0.05）;in orexin-A sensitive GD-I neurons，the discharge frequency of 64.71% neurons were significantly rised（P<0.05）.Orexin-A receptor antagonist SB-334867 could inhibit the effects（P<0.05）.The gastric emptying of rats was significantly increased by microinjection of Orexin-A in VTA（P<0.05） or electrical stimulation of LHA（P<0.05）.Pre-microinjection of SB-334867 into VTA could block the effects（P<0.05）.Conclusion：There is an Orexin-A pathway between LHA-VTA，which may be involved in the regulation of gastric function.

【Key words】 Orexin-A; LHA-VTA pathway; Gastric distension-sensitive neurons; Gastric emptying

First-authors address：School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266071，China

下丘腦包含室旁核（PVN）、弓狀核（ARC）、腹內(nèi)側(cè)核（VMH）、背內(nèi)側(cè)核（DMH）和外側(cè)區(qū)（LHA）等，主要通過協(xié)調(diào)行為、代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)等發(fā)揮作用[1]。下丘腦LHA因損傷后動(dòng)物模型出現(xiàn)攝食量下降和致死性的昏睡，一直被認(rèn)為是“饑餓中樞”和重要的覺醒核團(tuán)，且是中樞少數(shù)幾個(gè)表達(dá)神經(jīng)肽Orexin的核團(tuán)之一[2-3]。Orexin主要作用是促進(jìn)攝食和維持覺醒狀態(tài)，包括Orexin-A和Orexin-B兩種亞型，其受體為Orexin 1型和2型，在中樞廣泛分布，Orexin神經(jīng)元軸突在整個(gè)大腦中廣泛投射，有廣泛而復(fù)雜的功能[4-5]。

VTA是中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的核心腦區(qū)，在成癮藥物，如嗎啡作用下，VTA內(nèi)多巴胺（DA）神經(jīng)元被激活，使伏隔核（NAc）內(nèi)DA水平顯著升高，這是成癮藥物發(fā)揮獎(jiǎng)賞和強(qiáng)化效應(yīng)及成癮行為建立的重要神經(jīng)基礎(chǔ)[6]。進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VTA、NAc和LC等成癮和獎(jiǎng)賞行為反應(yīng)有關(guān)核團(tuán)內(nèi)存在Orexin神經(jīng)投射纖維[7]，且VTA注射Orexin激活VTA多巴胺能神經(jīng)元，增強(qiáng)由食物或藥物引發(fā)的獎(jiǎng)賞行為[8-10]。

本研究應(yīng)用神經(jīng)元單細(xì)胞外放電方法記錄電刺激LHA對(duì)VTA神經(jīng)元放電頻率，通過胃排空變化觀察VTA在Orexin調(diào)控?cái)z食中的作用，從而能夠?qū)HA表達(dá)Orexin作用和VTA在攝食、代謝和獎(jiǎng)賞成癮間相互調(diào)控作用有進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，為肥胖和成癮治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

Sprague-Dawley（SD）健康大鼠，成年雄性，體重200～250 g，標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲水進(jìn)食無限制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按照《青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用管理辦法》要求進(jìn)行所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞外放電記錄共用大鼠90只，其中VTA注射Orexin-A后用50只，電刺激LHA后用40只。大鼠胃排空共用48只，其中VTA注射Orexin-A后用24只，隨機(jī)分為三組（n=8）：生理鹽水組、Orexin-A組、SB334867+Orexin-A組;電刺激LHA后用24只，隨機(jī)分為三組（n=8）：假電刺激組（SS）、電刺激組（ES）、SB334867+ES組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物麻醉 大鼠禁食18 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉（10%，300 mg/kg）。實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)動(dòng)物反應(yīng)程度酌情注射水合氯醛維持麻醉狀態(tài)，每次低于首劑量的1/3。

1.2.2 胃部手術(shù) 分離大鼠胃部，胃大彎側(cè)切開胃腔，長約

1 cm，開口處放入胃擴(kuò)張球囊，球囊接聚乙烯軟管到電子恒壓器，縫合胃部切口。再結(jié)扎胃幽門與十二指腸結(jié)合部，避免十二指腸反流。最后縫合腹部切口。為模擬胃部攝食擴(kuò)張，由電子恒壓器注射3～5 ml生理鹽水進(jìn)入胃內(nèi)球囊，持續(xù)20 s，間隔4 min，共2 h[11]。

1.2.3 VTA埋管術(shù) 空腹大鼠麻醉后固定于恒溫腦立體定位儀。參照Paxinos大鼠腦解剖圖譜[12]，按VTA（前囟后5.6～6 mm，正中線旁開0.5～1 mm，顱骨下8～9 mm）定位用牙科鉆在顱骨開口，將不銹鋼套管（29 G）緩慢插入VTA，用牙托粉固定，縫合頭皮。術(shù)后7 d，每日腹腔注射青霉素8萬單位。

1.2.4 玻璃微電極制備 按要求（尖端直徑約3～10 μm，電極阻抗5～20 MΩ）制備四管玻璃微電極[13]，1號(hào)管灌注0.2%滂胺天藍(lán)（pH 7.7），滂胺天藍(lán)內(nèi)插入銀電極絲，傳導(dǎo)電流信號(hào)至電生理記錄儀;2、3和4號(hào)管分別用于注射Orexin-A溶液、SB-334867溶液或0.5 mol/L氯化鈉溶液。

1.2.5 細(xì)胞外放電記錄 記錄前，監(jiān)聽器和記錄儀所示波形判斷玻璃微電極的尖端進(jìn)入空氣與瓊脂界面，再用微量推進(jìn)器緩慢將微電極送至監(jiān)測核團(tuán)。探尋、記錄穩(wěn)定的細(xì)胞外放電神經(jīng)元，并鑒別其是否為胃擴(kuò)張敏感神經(jīng)元。壓力注射儀經(jīng)2、3、4管將干預(yù)藥物分別注射于細(xì)胞表面，壓力：3.0～35.0 psi，給藥時(shí)間：100～1 500 ms/次，重復(fù)次數(shù)：2～5次[14]。神經(jīng)元放電信號(hào)經(jīng)放大器后輸入記錄儀，POWERLAB生物信號(hào)處理軟件分析神經(jīng)元放電頻率變化。

1.2.6 電刺激伏隔核 空腹大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀。參照Paxinos大鼠腦解剖圖譜，將刺激電極插入LHA（前囟后5.6～6 mm，正中線旁開0.5～1 mm，顱骨下8～9 mm），連接至電刺激器，設(shè)定參數(shù)：波寬0.5 ms，強(qiáng)度20 μA，頻率50 Hz，持續(xù)時(shí)間10 s[15]。實(shí)驗(yàn)后，多聚甲醛灌注固定，取腦行冠狀切片，HE染色觀察電極位置，電極位于LHA內(nèi)數(shù)據(jù)計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 胃排空實(shí)驗(yàn) 1.5 ml的酚紅注入空腹大鼠胃內(nèi)。20 min后，處死大鼠，分離幽門和賁門，分別結(jié)扎后取下完整胃部。胃大彎側(cè)剖開胃體，內(nèi)容物全部倒入100 ml NaOH溶液（0.1 N）中，緩慢攪勻后置于室溫1 h。5 ml待測液上清與0.5 ml三氯乙酸（20%）混勻后離心（3 000 r/min，20 min）。離心后取1 ml上清液與4 ml NaOH溶液（0.5 N）充分混合，測量混合液對(duì)560 nm光的吸收值。胃排空率計(jì)算公式如下：胃排空率（%）=（1-酚紅灌胃20 min后吸收值/酚紅標(biāo)準(zhǔn)吸收值）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Orexin-A對(duì)中腦腹側(cè)被蓋區(qū)胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響

本實(shí)驗(yàn)共用大鼠50只，在VTA內(nèi)共記錄到58個(gè)胃牽張敏感神經(jīng)元（GD），其中有41個(gè)神經(jīng)元放電頻率從（5.65±1.27）Hz增大至（7.73±2.33）Hz（P<0.05），為胃牽張興奮性神經(jīng)元（GD-E）。有17個(gè)神經(jīng)元放電頻率從（5.78±0.97）Hz減小至（3.42±0.56）Hz（P<0.05），為胃牽張抑制性神經(jīng)元（GD-I）。

VTA經(jīng)四管玻璃微電極微量注射Orexin-A，41個(gè)GD-E神經(jīng)元中，有28個(gè)神經(jīng)元（28/41，68.29%）放電頻率從（6.14±1.22）Hz升高到（9.21±1.43）Hz（圖1 A），有9個(gè)神經(jīng)元（9/41，21.95%）放電頻率從（6.87±1.46）Hz降低到（4.13±1.12）Hz，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余4個(gè)神經(jīng)元（4/41，9.76%）注射Orexin-A后放電頻率無顯著變化（P>0.05）。Orexin1型受體拮抗劑SB334867預(yù)處理VTA，可阻斷Orexin-A對(duì)GD神經(jīng)元的作用（P<0.05，圖1A）。

GD-I神經(jīng)元中，Orexin-A刺激12個(gè)神經(jīng)元（12/17，70.59%）放電頻率從（6.03±1.42）Hz升高到（9.22±1.90）Hz（P<0.05;圖1B），4個(gè)神經(jīng)元（4/17，23.53%）放電頻率被抑制，從（6.23±1.01）Hz下降到（3.12±0.92）Hz（P<0.05），1個(gè)神經(jīng)元（1/17，23.53%）對(duì)Orexin-A無明顯反應(yīng)（P>0.05）。VTA中預(yù)先注射SB334867，可阻斷Orexin-A對(duì)GD神經(jīng)元的影響（P<0.05，圖1B）。生理鹽水對(duì)VTA中GD神經(jīng)元放電頻率無影響（P>0.05）。

圖1 中腦腹側(cè)被蓋區(qū)中微量注射Orexin-A對(duì)大鼠胃牽張敏感神經(jīng)元的影響

注：A為GD-E神經(jīng)元;B為GD-I神經(jīng)元。

2.2 電刺激下丘腦LHA對(duì)VTA內(nèi)Orexin-A反應(yīng)性胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響

本組共用40只大鼠，在VTA中鑒別出43個(gè)GD-E神經(jīng)元，26個(gè)GD-I 神經(jīng)元。Orexin-A刺激31個(gè)GD-E神經(jīng)元（31/43，72.09%）和17個(gè)GD-I神經(jīng)元（11/17，64.71%）放電頻率升高。

上述31個(gè)GD-E神經(jīng)元中，22個(gè)（22/31，70.97%）放電頻率在電刺激LHA時(shí)加快，從（6.41±1.98）Hz升高至（12.55±3.35）Hz（P<0.05，圖2A），6個(gè)（6/31，19.35%）放電頻率減慢[（6.15±2.06）Hz vs （3.49±1.27）Hz，P<0.05，圖2A]，其余3個(gè)（3/31，9.68%）神經(jīng)元放電頻率無明顯變化（P<0.05，圖2A）。

17個(gè)可被Orexin-A激活的GD-I神經(jīng)元中，11個(gè)神經(jīng)元（11/17，64.71%）在電刺激LHA時(shí)出現(xiàn)興奮狀態(tài)，放電頻率升高[（6.28±1.28）Hz vs （9.65±2.29）Hz，P<0.01，圖2B]，5個(gè)（5/17，29.41%）神經(jīng)元放電頻率受抑制[（6.91±1.78）Hz vs （4.02±1.06）Hz，

P<0.05]，1個(gè)（1/17，5.88%）神經(jīng)元的放電頻率無顯著變化（P>0.05）。

進(jìn)一步研究電刺激LHA對(duì)VTA中GD神經(jīng)元調(diào)控作用是否通過orexin遞質(zhì)通路，VTA中預(yù)先注射SB334867降低電刺激LHA對(duì)VTA內(nèi)GD-神經(jīng)元放電頻率的作用（P<0.05，圖2A、2B）。VTA內(nèi)單獨(dú)注射SB334867，GD-E神經(jīng)元和GD-I神經(jīng)元放電頻率均未出現(xiàn)顯著改變（P>0.05，圖2A、2B）。

圖2 VTA微量注射Orexin-A對(duì)大鼠GD神經(jīng)元放電頻率的影響

注：A為GD-E神經(jīng)元;B為GD-I神經(jīng)元。

2.3 VTA微量注射Orexin-A對(duì)大鼠胃排空的影響

VTA微量注射Orexin-A后，Orexin-A組大鼠20 min胃排空率與生理鹽水組相比顯著增加[（94.4±3.9）% vs （78.2±16.7）%，P<0.05，圖3]。SB334867預(yù)處理VTA顯著降低Orexin-A引起的大鼠胃排空增加[（81.2±4.2）%，P<0.05]。

圖3 中腦腹側(cè)被蓋區(qū)微量注射Orexin-A對(duì)大鼠胃排空的影響

*與生理鹽水組相比，P<0.05;#與SB334867+Orexin-A組比較，P<0.05。

2.4 電刺激下丘腦LHA對(duì)胃排空的影響

與VTA中注射Orexin-A類似，LHA電刺激促進(jìn)胃排空。電刺激LHA（50 mA）20 min后，胃排空率較假電刺激組增加[（74.67±4.76）% vs （60.79±3.98）%，圖4]，與假電刺激組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。電刺激LHA前VTA中注射SB334867（6 μg），電刺激LHA增加胃排空的作用減輕，排空率為（63.56±2.54）%，與LHA電刺激組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上結(jié)果提示LHA可通過VTA調(diào)控胃排空，且LHA和VTA間Orexin-A神經(jīng)通路發(fā)揮重要作用。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Orexin-A刺激VTA中胃牽張敏感神經(jīng)元放電頻率變化，電刺激下丘腦LHA區(qū)域也影響VTA中胃牽張敏感神經(jīng)元放電頻率，Orexin1型受體拮抗劑SB334867可阻斷此作用;胃排空實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VTA注射Orexin-A和電刺激LHA均增加胃運(yùn)動(dòng)，且SB334867預(yù)處理后胃運(yùn)動(dòng)無顯著增加。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VTA內(nèi)胃牽張敏感神經(jīng)元在Orexin-A刺激后放電頻率發(fā)生變化，興奮性部分增加，部分降低或無反應(yīng)，提示VTA內(nèi)胃牽張敏感神經(jīng)元大部分表達(dá)Orexin-A受體。關(guān)于Orexin-A在VTA內(nèi)作用機(jī)制，Borgland等[16-17]發(fā)現(xiàn)急性應(yīng)用Orexin-A能夠通過PKC/PLC信號(hào)通路劑量依賴性增加NMDA受體后興奮性突觸后電位，但對(duì)AMPA受體后興奮性突觸后電位無作用。Chiou等[18]還發(fā)現(xiàn)Orexin-A激活Gq/11偶聯(lián)的PLC-DAGL通路，再通過2-花生酰甘油三酯（2-AG）逆行抑制GABA產(chǎn)生和釋放。本實(shí)驗(yàn)電刺激LHA后，VTA部分神經(jīng)元放電頻率發(fā)生變化，說明LHA與VTA間存在信號(hào)傳遞，且1型受體拮抗劑SB334867預(yù)處理能夠抑制此影響，進(jìn)一步表明LHA內(nèi)部分Orexin-A沿神經(jīng)元軸突纖維投射至VTA發(fā)揮作用。

既然VTA內(nèi)胃運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)元對(duì)Orexin-A有反應(yīng)，那么Orexin-A在VTA內(nèi)是否參與胃運(yùn)動(dòng)的調(diào)控，LHA到VTA的神經(jīng)元投射又有什么功能？本實(shí)驗(yàn)觀察VTA內(nèi)注射Orexin-A促進(jìn)大鼠胃排空，與Orexin-A外周或中樞DMN內(nèi)注射作用一致。電刺激LHA后胃排空增強(qiáng)，且SB334867預(yù)處理阻斷其作用，提示電刺激LHA后促進(jìn)其表達(dá)Orexin-A，經(jīng)軸突傳遞至VTA后具有一定生理功能。VTA由DA、GABA和谷氨酸（GLU）釋放神經(jīng)元組成，其中DA神經(jīng)元最豐富，而GABA和GLU神經(jīng)元分別占總數(shù)的35%和2%～5%[19]。因VTA無直接神經(jīng)元投射至胃部，故推測Orexin-A刺激VTA興奮后，通過GABA或多巴胺（DA）等遞質(zhì)直接或間接影響DMN等迷走神經(jīng)核團(tuán)，再發(fā)揮調(diào)控胃排空作用。

本實(shí)驗(yàn)通過電生理學(xué)和胃排空變化，觀察LHA經(jīng)Orexin-A遞質(zhì)對(duì)VTA神經(jīng)元放電調(diào)控及對(duì)胃排空的促進(jìn)作用，完善了生理?xiàng)l件下LHA與VTA間Orexin遞質(zhì)作用，為進(jìn)一步研究Orexin在調(diào)控VTA有關(guān)的獎(jiǎng)賞性攝食和非生理性攝食提供新的研究思路，為肥胖和成癮治療提供新的理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-07-26） （本文編輯：何玉勤）

*基金項(xiàng)目：中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目

（項(xiàng)目編號(hào)：2018M632627;2018M630749）

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2018WS378）

①青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 山東 青島 266071

②淄博市臨淄區(qū)婦幼保健院

通信作者：高勝利