黃莉娟，趙麗麗，2*，唐華江，孫小富，王普昶，陳 超

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3. 貴州省晴隆縣草地畜牧中心，貴州 晴隆 561400；4. 貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】干旱是影響植物生長(zhǎng)的逆境因子之一。干旱脅迫下植物的膜脂過(guò)氧化物、保護(hù)酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等發(fā)生變化，自由基累積引起膜傷害和膜脂過(guò)氧化等作用[1-2]。丙二醛(MDA)是反映細(xì)胞膜過(guò)氧化作用的重要指標(biāo)，其累積量與細(xì)胞膜過(guò)氧化作用呈正相關(guān)；植物體內(nèi)的抗氧化酶〔如過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)〕和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)〔如可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)〕組成了植物體內(nèi)清除自由基的抗氧化系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[2-5]。不同植物，甚至同種植物不同種質(zhì)對(duì)干旱的生理響應(yīng)不同，抗旱性也存在差異。丁龍等[6]指出，黑果枸杞、金露梅、蒙古蕕、檸條和花棒等5種西北旱區(qū)植物可通過(guò)積累有機(jī)溶質(zhì)和提高抗氧化酶活性減輕植物細(xì)胞在干旱脅迫下受到的傷害，且各植物在光合作用及生理生化等方面對(duì)土壤干旱脅迫做出了積極響應(yīng)，但不同植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性不同。張薈薈等[7]研究12份苜蓿(MedicagoSative)種質(zhì)材料苗期抗旱性指出，不同種質(zhì)材料間的抗旱性存在差異。毛花雀稗(Paspalumdilatatum)是多年生草本植物，原產(chǎn)于南美，適應(yīng)性強(qiáng)，在貴州廣泛分布于海拔2 200米以下地區(qū)。具有產(chǎn)量高、適口性好、營(yíng)養(yǎng)豐富、抗寒耐旱、四季常綠等特性，常作為優(yōu)良牧草引種栽培[8-9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，關(guān)于毛花雀稗的研究主要集中在產(chǎn)草量、種質(zhì)比較、混播草地建植技術(shù)、生育特性和馴化栽培等方面[9-13]，而針對(duì)干旱脅迫下毛花雀稗生理響應(yīng)機(jī)制的系統(tǒng)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】研究植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)發(fā)掘抗旱的種質(zhì)材料具有重要意義。為此，以6個(gè)不同來(lái)源的毛花雀稗種質(zhì)為研究對(duì)象，采用盆栽干旱模擬試驗(yàn)，研究不同種質(zhì)的生理適應(yīng)機(jī)制。但因不同種質(zhì)對(duì)逆境的反應(yīng)不同，其各項(xiàng)生理指標(biāo)變化亦不同，單一生理指標(biāo)無(wú)法準(zhǔn)確反應(yīng)出6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)的抗性能力強(qiáng)弱，但多個(gè)生理指標(biāo)之間難免會(huì)有信息重疊，使用隸屬函數(shù)法對(duì)植物進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)具有一定的局限性[14]，利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法相結(jié)合，探討各種質(zhì)間的抗旱性強(qiáng)弱?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】篩選抗旱性較強(qiáng)的毛花雀稗種質(zhì)，為毛花雀稗抗旱型種質(zhì)的選育與推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛花雀稗。6份種質(zhì)，其資源信息詳見(jiàn)表1，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 ①種子處理。選擇均一、飽滿(mǎn)、無(wú)病蟲(chóng)害的種子，依照國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程[15]，將供試種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽。②幼苗移栽。待幼苗長(zhǎng)出后，移入由河沙∶蛭石∶腐殖質(zhì)土按體積1∶1∶1混勻的花盆中，放置溫室內(nèi)統(tǒng)一進(jìn)行日常管理。③栽培基質(zhì)處理。栽培基質(zhì)為腐殖質(zhì)土、自然土壤和蛭石(體積比1∶3∶1)的混合土壤。將基質(zhì)放入烘箱中100 ℃處理12 h，使土壤持水量保持均一，每盆裝5.0 kg混合基質(zhì)備用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)根據(jù)毛花雀稗種質(zhì)設(shè)6個(gè)處理，即每個(gè)種質(zhì)1個(gè)處理。選取生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的不同種質(zhì)毛花雀稗幼苗分別移栽至裝有栽培基質(zhì)的塑料盆中，每盆定植1株，期間管理同田間管理一致。待植株適應(yīng)后，將基質(zhì)澆水至飽和持水量，以后不再澆水使其逐漸自然干旱，3次重復(fù)。

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法 分別在干旱處理后的第0天(對(duì)照)、第7、14、21和28天采集健康的植物葉片測(cè)定丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和葉綠素a+b[Chl(a+b)]等生理指標(biāo)，3次重復(fù)。參照文獻(xiàn)[16-20]的方法，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定，SS含量采用蒽酮比色法測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定，Chl含量采用分光光度法測(cè)定。

表1 6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)的資源信息

1.2.4 抗旱性綜合評(píng)價(jià) 采用主成分分析法對(duì)6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)的MDA、SP、SS、POD、CAT、Chl a、Chl b和Chl(a+b)等生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，按累積貢獻(xiàn)率≥85 %確定主成分個(gè)數(shù)；參照文獻(xiàn)[21-22]的方法，根據(jù)主成分分析結(jié)果計(jì)算主成分得分值、權(quán)重、隸屬函數(shù)及綜合評(píng)價(jià)分值。

Xi=∑[Ai·zi](i=1，2，3，…，n)

Wi=Pi/∑Pi(i=1，2，3，…，n)

U(xi)=(xi-ximin) / (ximax-ximin)

D=∑[U(xi) ·Wi](i=1，2，3，…，n)

式中：Ai，第i個(gè)毛花雀稗種質(zhì)的特征向量值；zi，第i個(gè)毛花雀稗種質(zhì)生理指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值；Wi，第i個(gè)主成分在所有主成分中的重要程度；Pi，各種質(zhì)第i個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率；U(xi)，各種質(zhì)第i個(gè)主成分的隸屬函數(shù)值；xi，各種質(zhì)某一主成分得分值；ximax、ximin，所有參試種質(zhì)中第i個(gè)主成分的最大值與最小值；D，綜合抗旱性評(píng)分值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下毛花雀稗主要生理指標(biāo)的變化

2.1.1 丙二醛(MDA)含量 6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)葉片MDA含量均隨干旱時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)。0～21 d 時(shí)6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)的MDA含量各階段均較初始階段顯著增加，但增幅較緩慢，其中，種質(zhì)No.1、No.2、No.4和No.5的增幅均較小。21～28 d時(shí)各種質(zhì)MDA含量急劇增加并達(dá)到峰值，其中，No.3和No.6的增幅較大，顯著高于前一階段的含量，分別為對(duì)照(第0天，下同)的23.18和17.93倍；No.1增幅最小，僅較對(duì)照增加5.50倍。第28天時(shí)MDA的含量為No.3>No.6>No.2>No.4>No.5>No.1，No.3和No.6的MDA含量均顯著高于其余4個(gè)種質(zhì)(圖1)。

2.1.2 過(guò)氧化物酶(POD)活性 6個(gè)毛花雀稗POD活性隨干旱程度增加呈先升后降趨勢(shì)。0～14 d時(shí)各種質(zhì)POD活性均顯著增加，并達(dá)到最大值，其中，No.1的增幅最大，為對(duì)照的1.75倍。隨干旱程度增強(qiáng)，14～28 d時(shí)各種質(zhì)的POD活性呈逐漸降低趨勢(shì)。第28天時(shí)各種質(zhì)的POD活性急劇下降至最小值，其中，No.3降幅最大且顯著低于其余5個(gè)種質(zhì)，較對(duì)照下降148.15 U/mg；No.1的降幅最小，較對(duì)照僅下降70.05 U/mg；No.2和No.5的POD活性均顯著高于其余4個(gè)種質(zhì)。

2.1.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性 隨干旱時(shí)間延長(zhǎng)各種質(zhì)CAT活性均呈先升后降趨勢(shì)。第14天時(shí)各種質(zhì)CAT活性均達(dá)峰值，其中，No.6的增幅最大，較對(duì)照增加5.87 U/mg；No.2的增幅最小，較對(duì)照僅增加1.91 U/mg。之后各種質(zhì)隨干旱時(shí)間的增加呈逐漸下降趨勢(shì)，第28天時(shí)No.6的降幅最大，較第14 天下降5.32 U/mg；No.4的降幅最小，較第14天下降1.32 U/mg；第28天時(shí)No.4的CAT活性顯著高于其余5個(gè)種質(zhì)。

2.1.4 可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量 6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)SP含量隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)。No.6在干旱脅迫第7天時(shí)SP含量達(dá)到峰值，其余5個(gè)種質(zhì)則均在干旱脅迫第14天達(dá)到峰值；其中，No.1和No.2的增幅較大，分別較對(duì)照增加0.77和0.69 g/mL。之后各種質(zhì)SP含量呈下降趨勢(shì)，第28天時(shí)僅No.5和No.6的SP含量低于對(duì)照，二者分別較對(duì)照下降0.07和0.38 g/mL；但No.5與No.2和No.3差異不顯著，No.6的SP含量顯著低于其余種質(zhì)。

2.1.5 可溶性糖(SS)含量 隨干旱脅迫程度增強(qiáng)，6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)SS含量總體呈顯著增加趨勢(shì)，均于第28天時(shí)達(dá)到峰值。其中，No.1、No.4和No.6的SS含量均顯著高于其余3個(gè)種質(zhì)，與對(duì)照相比較對(duì)照增加23.41、25.70和22.08 mg/g；No.5的SS含量最小，較對(duì)照僅增加15.71 mg/g。

2.1.6 葉綠素(Chl)含量 6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)的Chl a、Chl b及Chl(a+b)含量均隨干旱程度增強(qiáng)呈顯著降低趨勢(shì)。第28天時(shí)No.2的Chl a含量降幅最大，較對(duì)照下降3.14 mg/g；No.5的Chl b含量降幅最大，并均顯著低于其余5個(gè)種質(zhì)，較對(duì)照下降0.97 mg/g；No.2的Chl(a+b)含量降幅最大，但與No.1、No.3和No.5差異不顯著，與No.4和No.6差異顯著，較對(duì)照下降2.70 mg/g；No.6的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量降幅最小，并顯著高于其他種質(zhì)，與對(duì)照相比Chl a、Chl b和Chl(a+b)分別下降1.46、0.70和1.67 mg/g，表明，其受干旱影響較小。

2.2 毛花雀稗抗旱性綜合評(píng)價(jià)

從表2看出，主成分1、2和3解釋的方差分別占總方差的42.834 %、34.980 %和14.827 %，累積貢獻(xiàn)率達(dá)92.641 %，能有效地解釋干旱脅迫下毛花雀稗種質(zhì)的生理響應(yīng)，因此，可以用前3個(gè)主成分代替上述8個(gè)生理指標(biāo)對(duì)毛花雀稗種質(zhì)的抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。主成分中各指標(biāo)的特征向量代表單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)主成分的貢獻(xiàn)度大小。第一主分中SP的特征向量最大、Chl b與Chl(a+b)次之，這些指標(biāo)主要與滲透調(diào)節(jié)和光合作用有關(guān)，因此，第一主分稱(chēng)為滲透調(diào)節(jié)和光合作用因子。第二主分中CAT的特征向量最大，Chl a次之，CAT主要與清除膜脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物有關(guān)，葉綠素a主要與光合作用有關(guān)，因此，第二主分稱(chēng)為抗氧化與光合作用因子。第三主分中SS的特征向量最大，SS屬于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因此，第三主分稱(chēng)為滲透調(diào)節(jié)因子。經(jīng)計(jì)算得出3個(gè)主成分的權(quán)重分別為0.462、0.378和0.160。從表3看出，美國(guó)種質(zhì)的抗旱性最強(qiáng)，其綜合抗旱性D值為2.00；其次為貴州安龍(草坡)種質(zhì)，D值為1.73；越南種質(zhì)的抗旱性最弱，D值為-0.29；其他種質(zhì)D值為0.78～1.34，抗旱性居中。

圖中不同小寫(xiě)字母表示同一種質(zhì)不同時(shí)期的差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示不同種質(zhì)在第28天時(shí)的差異顯著(P<0.05)Different capital and lowercase letters in the figures indicate significance of difference at 1 % and 5 % levels respectively圖1 干旱脅迫6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)主要生理指標(biāo)的變化Fig.1 Variation of MDA，soluble protein，POD and CAT activity under drought stress

表2 干旱脅迫6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)各生理指標(biāo)的主成分分析

表3 6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)抗旱性的隸屬函數(shù)分析

3 討 論

植物在干旱脅迫下體內(nèi)過(guò)氧化物質(zhì)O2-和H2O2等增加，使膜脂過(guò)氧化，其中主要產(chǎn)物MDA積累量的高低是反映植物細(xì)胞膜在逆境條件下受傷害程度及過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[23-24]。前人對(duì)柳枝稷(Panicumvirgatum)[25]、大花飛燕草(Delphiniumgrandiflorum)[26]和冰草(Agropyroncristatum)[27]等植物的研究表明，隨干旱時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量逐漸增加，其含量與植物抗旱能力呈反比。研究結(jié)果表明，隨干旱時(shí)間的增加，6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)MDA含量均表現(xiàn)為0～21 d緩慢增加，在第28天迅速積累到最大值，表明，此時(shí)植物保護(hù)酶系統(tǒng)崩潰，植物體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)氧化物質(zhì)不再被清除，細(xì)胞膜過(guò)氧化程度加劇、受損嚴(yán)重，導(dǎo)致MDA含量驟然升高。6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)中，美國(guó)種質(zhì)的MDA含量最低，越南、貴州湄潭種質(zhì)的MDA含量較高。表明，逆境下美國(guó)種質(zhì)的細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化程度小，有較強(qiáng)的抗旱能力；相反越南種質(zhì)、貴州湄潭種質(zhì)的細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化程度大，抗旱能力較弱。

POD和CAT是植物清除活性氧的2種重要保護(hù)酶，具有消除自由基和降低膜脂過(guò)氧化的功能，且能較好的反應(yīng)植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力[28]。研究結(jié)果表明，隨干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)的POD和CAT酶活性對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)基本相同，均呈先升后降趨勢(shì)，與謝小玉等[29]對(duì)辣椒開(kāi)花結(jié)果期保護(hù)酶系統(tǒng)的研究結(jié)果相似，表明，毛花雀稗在干旱脅迫前期(7 d)和中期(14 d)能夠及時(shí)啟動(dòng)保護(hù)酶系統(tǒng)進(jìn)而有效地清除植物體內(nèi)的過(guò)氧化物，這是毛花雀稗對(duì)環(huán)境脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)。但隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，毛花雀稗體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)受損，POD與CAT活性逐漸降低，過(guò)氧化物質(zhì)的產(chǎn)生與清除失衡。在28 d時(shí)POD活性急劇下降達(dá)到最低值，表明，此時(shí)POD對(duì)過(guò)氧化物質(zhì)的清除能力最弱，這可能是導(dǎo)致MDA含量在干旱第28天時(shí)迅速積累到最大值的原因；其中，越南種質(zhì)的POD活性降幅最大，且顯著低于其余5個(gè)種質(zhì)，表明，越南種質(zhì)的抗氧化酶系統(tǒng)受損嚴(yán)重。

植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SS和SP)的積累是植物響應(yīng)外界環(huán)境脅迫最常見(jiàn)的反應(yīng)之一，這些物質(zhì)的積累能維持植體內(nèi)滲透勢(shì)的穩(wěn)定，保證植物體內(nèi)正常代謝活動(dòng)的進(jìn)行[30]。SP含量是反應(yīng)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成及降解等多方面信息的重要指標(biāo)[31-32]。研究結(jié)果表明，隨干旱時(shí)間的延長(zhǎng)各毛花雀稗種質(zhì)的SP含量總體呈先增后減趨勢(shì)，可能是在干旱脅迫前期(0～7 d)和中期(7～14 d)，植物為了適應(yīng)逆境環(huán)境誘導(dǎo)抗逆蛋白合成，以維持植物細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì)穩(wěn)定，保證植物代謝的正常進(jìn)行；脅迫后期(14～21 d)和末期(21～28 d)植物的SP含量達(dá)到峰值后隨之降低，可能是隨時(shí)間的延長(zhǎng)，干旱程度逐漸加重，植物體內(nèi)的SP合成速度逐漸減弱，而降解速度逐漸增快[31]所致；SS可使植物細(xì)胞脫水后保持其基本結(jié)構(gòu)，減少植物在干旱脅迫下受到的損害，提高植物的抗逆性[33-34]。研究結(jié)果表明，隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)SS含量均呈顯著增加趨勢(shì)。即逆境脅迫下，植物可通過(guò)增加SS的含量維持植物體內(nèi)的滲透勢(shì)穩(wěn)定，減少逆境對(duì)植物造成的損害。與崔婷茹等[35]對(duì)狼尾草(Pennisetumalopecuroides)的SS含量研究結(jié)果一致。在第28天時(shí)，美國(guó)種質(zhì)的SP和SS含量最高，表明，種質(zhì)美國(guó)種質(zhì)的滲透勢(shì)較其他種質(zhì)穩(wěn)定。

植物光合能力的強(qiáng)弱依賴(lài)于植物葉片中Chl含量的高低，Chl含量隨著葉組織水分的下降而減少，因此干旱脅迫下Chl含量的變化不僅可以反映植物對(duì)水分脅迫的敏感性還能體現(xiàn)植物抵御逆境脅迫的能力，抗性越強(qiáng)的植物在干旱脅迫條件下其Chl含量下降幅度越小[36-38]。研究結(jié)果表明，Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量隨干旱脅迫的加劇均呈顯著下降趨勢(shì)，可能是干旱脅迫引起植物葉片失水，影響Chl的生物合成或使已合成的Chl分解，致使植物葉片Chl含量隨之降低。但不同種質(zhì)的降幅不同，6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)中貴州湄潭種質(zhì)的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量的降幅最小，表明，干旱脅迫下貴州湄潭種質(zhì)對(duì)水分脅迫敏感性較弱，即抗旱性較強(qiáng)。與MIN-WHA等[39]對(duì)朵麗蝶蘭(Doritaenopsishybrid)Chl含量變化的研究結(jié)果相同。

4 結(jié) 論

為全面、準(zhǔn)確地掌握6個(gè)毛花雀稗材料的抗旱性，該研究利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法相結(jié)合，主成分分析將有內(nèi)在聯(lián)系的8個(gè)生理指標(biāo)轉(zhuǎn)換為3個(gè)新的彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)，克服了信息重疊與指標(biāo)的相關(guān)性，不僅避免單一指標(biāo)的片面性，又能在多指標(biāo)的基礎(chǔ)上對(duì)6個(gè)毛花雀稗種質(zhì)進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)。根據(jù)綜合抗旱性D值得出，美國(guó)種質(zhì)抗旱性最強(qiáng)，其次為貴州安龍(草坡)種質(zhì)，而越南種質(zhì)抗旱性最弱，貴州湄潭、貴州安龍(河谷)和貴州獨(dú)山種質(zhì)等3個(gè)種質(zhì)的抗旱性居中。因此，在毛花雀稗抗旱性牧草種質(zhì)的選育與推廣中，應(yīng)優(yōu)先選擇抗旱性較強(qiáng)的美國(guó)種質(zhì)。