吳尤嬌，陳汀波，姬云青，程春松,，張子凌，周 華,，羅 培,，張志鋒,*

1澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，澳門特別行政區(qū) 519020

火炭母PolygonumchinenseL.來源于蓼科Polygonaceae蓼屬Polygonum，最早被記錄在1977年版《中國藥典》，其來源為植物火炭母原變種(PolygonumchinenseL.var.Chinense)及其變種硬毛火炭母(PolygonumchinenseL.var.Hispidum)的干燥全草[1]?；鹛磕竸e名老鼠蔗、火炭藤、烏炭子等，主要分布于廣西、廣東、福建、浙江、湖北及海南等地，是嶺南習(xí)用的一味中草藥，同時(shí)也是多種廣東涼茶的主要成分之一[2]。其性寒、味微酸、澀，具有清熱祛濕、涼血解毒、活血通絡(luò)、平肝明目等功效，臨床主要用于治療痢疾、皮炎濕疹、角膜云翳等病癥。現(xiàn)代藥理研究表明，火炭母具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腹瀉、抗肝癌、抗病毒、抗氧化、抑制中樞神經(jīng)等作用[3]?；鹛磕钢饕瑩]發(fā)油類、黃酮類、鞣質(zhì)類、酚酸類等成分[2]。2004年版的《廣東省藥材標(biāo)準(zhǔn)》以及2017年出版的《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中，均僅收載火炭母一種[4,5]。但據(jù)本項(xiàng)目調(diào)查，發(fā)現(xiàn)火炭母原變種與硬毛火炭母分布地區(qū)相同，有的甚至在同一地方兩種混生，因而，在民間以及涼茶中，兩種基原都不加區(qū)別的使用。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)對二者的化學(xué)成分及品質(zhì)進(jìn)行比較研究。因此，本研究首次對火炭母的兩個(gè)不同基原——火炭母原變種和硬毛火炭母變種，運(yùn)用UHPLC-QTOF-MSMS對其化學(xué)成分進(jìn)行比較研究，為二者是否可以等同入藥提供科學(xué)依據(jù)，為藥材標(biāo)準(zhǔn)的修訂及品質(zhì)評價(jià)提供參考資料。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent Technologies 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS)、MassHunter 6.0工作站；色譜柱為Waters ACQUITY HSS-C18Column(1.8 μm，2.1×100 mm)；AUY220電子天平(SHIMADZU，日本)；CP500HT型超聲波清洗器(Crest Ultrasonics，美國)；高速離心機(jī)(Eppendorf，德國)；乙腈、甲醇(Merck，德國，HPLC級(jí))；甲酸(Fluka，瑞典，HPLC級(jí))；Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，美國)。

沒食子酸對照品(批號(hào)110831-171010)、綠原酸對照品(批號(hào) 110753-201716)、鞣花酸對照品(批號(hào) 111959-201602)和槲皮苷對照品(批號(hào)111538-201606)均購自中國食品藥品檢定所。火炭母及硬毛火炭母樣品分別于2017年6月采集于廣西崇左、北海、欽州、柳州、廣東茂名和清遠(yuǎn)等地，每個(gè)產(chǎn)地采集樣品5份。經(jīng)四川大學(xué)華西藥學(xué)院生藥教研室張浩教授鑒定：廣西南寧、北海和欽州的樣品為蓼科植物火炭母原變種P.chinensevar.chinense的干燥全草；廣西柳州、廣東茂名和清遠(yuǎn)的樣品為其變種硬毛火炭母P.chinensevar.hispidum的干燥全草。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超高效液相色譜條件

色譜柱為Waters Acquity HSS-C18(1.8 μm，2.1×100 mm)，以0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相(A)，乙腈為流動(dòng)相 (B)，梯度洗脫為0～7 min，8%～27% B；7～10 min，27%～27% B；10～12 min，27%～65% B。流速0.30 mL/min，自動(dòng)進(jìn)樣5 μL，柱溫30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)離子源，負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，離子源參數(shù)毛細(xì)管電壓為3 200 V，錐孔電壓40 kV，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣(N2)體積流量700 L/h，碰撞能量(CE)30～45 V。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用MassHunter 6.0軟件處理。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、綠原酸、鞣花酸、槲皮苷對照品適量，置于10 mL容量瓶中，以60%乙醇溶液溶解，樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后制成混合對照品儲(chǔ)備液。

2.4 供試品溶液的制備

分別精密稱取各產(chǎn)地火炭母原變種、硬毛火炭母粗粉各0.25 g，置于25 mL容量瓶中，分別精密加入60%乙醇10 mL為提取溶劑，精密稱定重量，超聲提取30 min(100 W，40 kHz)，溫度60 ℃。放置至室溫后，精密稱定重量，以提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，經(jīng)微孔濾膜0.22 μm過濾，即得火炭母原變種、硬毛火炭母供試液。

圖1 火炭母原變種(A)與硬毛火炭母(B)UHPLC-TOF-MSMS總離子流色譜圖Fig.1 P.chinense var.chinense (A) and P.chinense var.hispidum (B) UHPLC-TOF-MSMS total ion chromatogram

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 火炭母原變種和硬毛火炭母總離子流圖比較

UHPLC-MS 中質(zhì)譜檢測有正、負(fù)離子兩種掃描模式，火炭母原變種中以黃酮類、酚酸類為主要成分，其在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好[6]，故本實(shí)驗(yàn)選擇負(fù)離子掃描模式，質(zhì)譜總離子流圖(TIC)見圖1。硬毛火炭母的離子流圖中，在6～7 min出現(xiàn)了23號(hào)峰，而在火炭母原變種的離子流圖中該保留時(shí)間并未出現(xiàn)化合物；火炭母原變種的離子流圖中，在10～12 min出現(xiàn)了28、29號(hào)峰，而在硬毛火炭母的離子流圖中該保留時(shí)間未出現(xiàn)化合物。

3.2 UHPLC-QTOF-MSMS成分分析

采用 MassHunter 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)負(fù)離子模式下各化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，并結(jié)合提取離子流圖及與對照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比進(jìn)行化學(xué)成分確認(rèn)，鑒定或推斷了25個(gè)化合物，包括17個(gè)酚酸類、8個(gè)黃酮類成分。結(jié)果見表1。

表1火炭母原變種與硬毛火炭母UHPLC-TOF-MSMS色譜圖中指認(rèn)的色譜峰

Table 1 UHPLC-TOF-MSMS identified in the chromatogram ofP.chinensevar.chinenseandP.chinensevar.hispidum

峰號(hào)NO.保留時(shí)間tR(min)分子式Formula理論值Calc.Mass (m/z)測定值 Measured mass (m/z)偏差Error ppm 二級(jí)質(zhì)譜MS/MS data (m/z)化合物Compound11.16C14H12O11355.030 7355.031 2-1.4193,163,179,133訶子次酸 Chebulagic acid [7]21.23C7H12O6191.056 1191.056 4-1.5130,111,123,138,162檸檬酸 Citrate acid [8]31.46C7H6O5169.014 2169.014 01.5125沒食子酸 Gallic acid [7]41.87C7H12O6191.057 2191.056 1-5.7101,115,162,130檸檬酸同分異構(gòu)體Lsomer of citrate acid [8]Somer of citrate acid [9]51.96C17H24O9371.134 8371.134 02209,133,103,244紫丁香苷 Syringin [9]62.11469.061 5169,125,247,219Unknow72.42C16H18O9353.087 8353.087 70.3191,135,155綠原酸同分異構(gòu)體 Lsomer of chlorogenic acid [9]82.8C19H18O13453.067 5453.068 0-1.2301,274,169,2737-OxO-1,3,5-cycloheptatriene-1,2,3,4,5,6-hexayl hexaacetate93.03C19H18O13453.067 5453.068 5-2.3301,247,273,169,217Isomer of 7-oxo-1,3,5-cycloheptatriene-1,2,3,4,5,6-hexayl hexaacetate103.26C16H18O9353.087 8353.088 0-0.5191,135,155綠原酸Chlorogenic acid [9]113.51C13H8O8291.014 6291.016 7-7.1247,191,219短葉蘇木酚酸Brevifolin carboxylic acid [10]123.75C27H22O18633.073 3633.074 2-1.3481,169,125,275,381柯里拉京同分異構(gòu)體 Lsomer of corilagin [11]133.98951.077 2301,169,465,633Unknow144.06C27H22O18633.073 3633.074 2-1.4481,301,169,463柯里拉京Corilagin [11]154.86275.012 3229,257,201unknow165.18C28H32O16623.161 8623.164 0-3.6301,175,113 Rhamnazin-3-o-rutinoside [12]175.42C21H20O11477.093 3477.093 8-1.2301,151,163,249,367槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷同分異構(gòu)體Isomer of quercetin-3-O-glucuronide [7]185.6C14H6O8300.999 0301.001 1-7145,117,173,200,101鞣花酸Ellagic acid [7]195.99C21H18O13477.067 5477.066 61.8301,151,179,245,328槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷 Quercetin-3-O-glucuronide [7]206.17C22H18O10441.082 7441.083 5-1.7289,169,125,245左旋表兒茶素-3-O-沒食子酸酯 Epicatechin-3-O-gallate [13]216.41979.108 7301,169,363,933,633Unknow226.6C15H12O8319.045 9319.047 5-4.9217,245,213Dihydromyricelin [14]

續(xù)表1 (Continued Tab.1)

峰號(hào)NO.保留時(shí)間tR(min)分子式Formula理論值Calc.Mass (m/z)測定值 Measured mass (m/z)偏差Error ppm 二級(jí)質(zhì)譜MS/MS data (m/z)化合物Compound236.93C21H20O11447.093 3447.094 3-1.8300a槲皮苷 Quercitrin [15]247.1C21H18O12461.072 5461.071 42.4315,273,169,125,209Scutellarin [16]257.23C15H8O8315.014 6315.015 5-2.7299,273,243,216,1883-O-甲基并沒食子酸 3-O-Methylgallic acid [17]267.64C15H8O8315.014 6315.016 0-4.3299,273,243,216,172 3-O-甲基并沒食子酸同分異構(gòu)體 Isomer Of 3-O-Methylgallic acid [17]278.05C22H18O13489.067 5489.067 40.1299,271,125,169,228Enyssoside [18]2810.36C16H10O8329.030 3329.030 6-0.9298,270,314b3,3′-二甲基鞣花酸 3,3′-Dimethyl ellagic acid[7]2910.9C23H20O13503.083 1503.082 70.8315b3-O-甲基鞣花酸-4-O-a-L-吡喃鼠李糖苷3-O-Methylellagic acid-4-O-a-L-rhamnopyranoside [19]

注：化合物3、10、18、23同時(shí)由對照品進(jìn)行確認(rèn)；a表示在火炭母原變種中未檢測到；b表示在硬毛火炭母中未檢測到。

NOte:The compounds 3,10,18 and 23 were confirmed by chemical reference substances,aIndicates undetected inP.chinensevar.chinens,bIndicates undetected inP.chinensevar.hispidum.

3.3 酚酸類化合物的鑒定[8-19]

酚酸類成分通過準(zhǔn)分子離子峰丟失沒食子?；鵰/z152是其典型的質(zhì)譜裂解規(guī)律，特征碎片離子m/z169可以作為推測酚酸類成分的依據(jù)。通過一級(jí)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，表1中含有較多m/z633、m/z453、m/z441、m/z191等分子離子峰，且部分大于m/z300的分子離子峰存在丟失沒食子?；鵰/z152的規(guī)律。以化合物20為例，Q-TOF/MSm/z441[M-H]-，在MS/MS圖譜中存在m/z289[M-H]-的碎片離子峰，兩者之間相差152，主要通過丟失沒食子?；鶊F(tuán)形成，根據(jù)碎片離子m/z289、m/z169、m/z125、m/z245推測該化合物為酚酸類成分左旋表兒茶素-3-O-沒食子酸酯。結(jié)合參考文獻(xiàn)，共鑒定出訶子次酸、檸檬酸、沒食子酸、檸檬酸同分異構(gòu)體、綠原酸同分異構(gòu)體、7-oxo-1,3,5-cycloheptatriene-1,2,3,4,5,6-hexayl hexaacetate、7-oxo-1,3,5-cycloheptatriene-1,2,3,4,5,6-hexayl hexaacetate同分異構(gòu)體、綠原酸、短葉蘇木酚酸、柯里拉京同分異構(gòu)體、柯里拉京、鞣花酸、左旋表兒茶素-3-O-沒食子酸酯、3-O-甲基并沒食子酸、 3-O-甲基并沒食子酸同分異構(gòu)體、3,3′-二甲基鞣花酸和3-O-甲基鞣花酸4-O-a-L-吡喃鼠李糖苷等17種酚酸類成分。

3.4 黃酮類化合物的鑒定

黃酮類成分中黃酮苷主要發(fā)生糖苷鍵的斷裂，形成失去一個(gè)或多個(gè)糖的次級(jí)苷和苷元的碎片離子。黃酮苷含有的糖基主要是鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和蕓香糖，ESI負(fù)離子模式下主要產(chǎn)生丟失該糖基的[M-H-146]-、[M-H-162]-、[M-H-162]-、[M-H-308]-碎片離子。黃酮苷元特征碎片離子m/z301、m/z151，也可以作為黃酮類化合物鑒定的有利證據(jù)。以化合物24為例，Q-TOF/MSm/z461.071 4 [M-H]-，產(chǎn)生脫去鼠李糖糖基的碎片離子[M-H-146]-，得到二級(jí)碎片離子m/z315，推測其為scutellarin。化合物19的Q-TOF/MSm/z477.066 6 [M-H]-，丟失1個(gè)葡萄糖醛酸[M-H-176]-，得到二級(jí)碎片離子m/z301[M-H-C6H12O5]-，根據(jù)碎片離子m/z179、m/z151推測m/z301為槲皮素母核，推測該化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。結(jié)合文獻(xiàn)，共鑒定出紫丁香苷、rhamnazin-3-O-rutinoside、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷同分異構(gòu)體、dihydromyricelin、槲皮苷、scutellarin和enyssoside等8種黃酮類成分。

3.5 通過對照品驗(yàn)證化合物

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的酚酸類和黃酮類成分的裂解規(guī)律，對本實(shí)驗(yàn)的化學(xué)成分質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行分析，提高鑒定的可信度，并根據(jù)對照品的保留時(shí)間、分子量和裂解碎片比對，鑒定出4個(gè)化合物，分別是化合物3(沒食子酸)、10(綠原酸)、18(鞣花酸)和23(槲皮苷)。

3.6 化學(xué)成分的相對含量變化

本實(shí)驗(yàn)通過提取各主要成分對應(yīng)的峰面積代表其相對含量，以18號(hào)化合物為參照，得到各樣品中同一化合物的相對峰面積的平均值，比較各化學(xué)成分在火炭母原變種與硬毛火炭母的相對含量變化，見圖2。由圖2可知，火炭母原變種和硬毛火炭母樣品中有26個(gè)共有化學(xué)成分，其共有成分在量上存在明顯的差異。

酚酸類化合物是兩種火炭母中含量較高的成分，其中化合物18、3和11的相對峰面積較高，說明其是火炭母中重要的酚酸類物質(zhì)?；衔?1、2和4在硬毛火炭母中的含量明顯高于火炭母原變種，而化合物20在火炭母原變種中的含量明顯高于硬毛火炭母。

黃酮類成分含量較高的化合物16、17、19、22和23，在硬毛火炭母中的含量明顯高于火炭母原變種。

差異化學(xué)成分有3個(gè)，分別是化合物23、28和29。其中化合物23只在硬毛火炭母中存在、且含量較大；火炭母原變種中含有在硬毛火炭母中未檢測到的酚酸類成分化合物28、29。

圖2 火炭母原變種與硬毛火炭母化學(xué)成分相對峰面積比較Fig.2 The comparison of relative area of chromatography peaks of P.chinense var.chinense and P.chinense var.hispidum注：A：火炭母原變種；B：硬毛火炭母。Note:A:P. chinense var. Chinense;B: P. chinense var. hispidum.

4 討論

根據(jù)負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜相對分子質(zhì)量，二級(jí)質(zhì)譜的裂解信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索及已報(bào)道文獻(xiàn)，對25個(gè)化合物進(jìn)行分析，推斷出其可能的成分。結(jié)果顯示，火炭母原變種及硬毛火炭母主要含酚酸類、黃酮類等成分，具有多羥基結(jié)構(gòu)、成分較復(fù)雜的特點(diǎn)。利用與對照品比對鑒定出沒食子酸、綠原酸、鞣花酸和槲皮苷等4個(gè)化合物，實(shí)驗(yàn)表明，UHPLC-QTOF-MSMS技術(shù)具有快速、精確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能有效地分析火炭母的成分及主要色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為控制火炭母藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

火炭母原變種和硬毛火炭母中各化學(xué)成分的含量存在明顯差異，其中酚酸類成分在兩種火炭母中的含量均較高、硬毛火炭母中黃酮類成分的含量明顯高于火炭母原變種。兩種火炭母最顯著的差異性物質(zhì)槲皮苷只存在于硬毛火炭母中，且含量較高，因此槲皮苷可作為區(qū)別火炭母原變種及硬毛火炭母藥材的重要參考標(biāo)準(zhǔn)。槲皮苷是一種黃酮類化合物，具有一定的抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、清除多種活性氧自由基、抗病毒、止血等藥理活性[20]。因而，槲皮苷的有無是否會(huì)導(dǎo)致藥理活性的差異尚不得之。本實(shí)驗(yàn)可為深入研究兩種不同基原火炭母藥理活性及臨床療效提供基礎(chǔ)資料，為擴(kuò)大藥源、更加全面研究火炭母藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和品質(zhì)評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。