于 玲 曹麗娟 孫 靜 周亞濱△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

心源性死亡仍然是目前世界范圍內導致死亡的主要原因，據調查數據顯示，每年有超過1 700萬人死于心血管疾?。?］。作為心源性死亡的獨立預測因素之一，冠狀動脈粥樣硬化斑塊病變是導致管腔狹窄、閉塞的主要原因，能夠引發(fā)心肌缺血或心肌壞死，增加冠狀動脈不良事件的風險［2］。因此，減少動脈粥樣硬化斑塊病變是改善患者預后的主要途徑之一。

作為血管壁最豐富的固有細胞，血管平滑肌細胞（VSMC）在維持血管張力和血管壁結構的構成中扮演著重要的角色。既往研究證實，VSMC的過度增殖是造成動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄和肺動脈高壓的病理學基礎，故調控VSMC的增殖和凋亡，是預防冠狀動脈病變的關鍵［3］。我們前期研究發(fā)現，蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）不僅能夠抑制炎性因子的分泌，還能夠改善動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈的組織形態(tài)和內皮細胞功能，并且抑制基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表達，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用［4］。因此本研究以細胞中miRNA-99a的表達為媒介，并通過觀察VSMC的增殖和凋亡水平，進一步探索SAEE的抗動脈硬化作用機制和作用靶點?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系 大鼠主動脈VSMC購于湖南豐暉生物科技有限公司，細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2。每3日換1次培養(yǎng)液，并以0.25%的胰酶消化傳代，取3～6代細胞用于實驗。

1.2 試劑與儀器 蘇木生藥購于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，經乙醇提取、乙酸乙酯萃取后得SAEE（生藥質量濃度設置為200 μg/mL）；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）購于廣州奕元生物科技有限公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國Thermo Fisher公司；青霉素-鏈霉素溶液購于上海酶聯生物研究所；Hilymax轉染試劑盒購于上海東仁化學科技有限公司；MTT細胞增殖試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；兔抗大鼠Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、MMP-1、TIMP-1、β-actin 單克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購于北京博爾邁生物技術有限公司。

1.3 細胞轉染與分組 miRNA-99a模擬劑（mimics）和抑制劑（inhibitor）由上海拓然生物科技公司設計并化學合成，按照試劑盒設定的轉染濃度，分別將miRNA-99a mimics和miRNA-99a inhibitor配制成終濃度為80 nmol/L和50 nmol/L的溶液。分別加入3 μL Hilymax轉染試劑，混勻，冰上靜置20 min。取對數生長期細胞，按照1×105/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL。當細胞長至80%融合時，更換為無胎牛血清的無抗生素DMEM培養(yǎng)液。將細胞分為5組，空白組（20%無血清無抗生素DMEM），模型組（50 μg/mL ox-LDL），SAEE 組（200 μg/mL SAEE），miRNA-99a mimics組（80 nmol/L miRNA-99a micmics）和 miRNA-99a inhibitor組（50 nmol/L miRNA-99a inhibitor）。

1.4 檢測指標 1）MTT法檢測細胞增殖：取不同處理方法干預后VSMC細胞以1×104/孔接種于96孔板中，每組設6個復孔，實驗平行設置24、48、72、96 h 4個時間點。每孔加入 20 μL MTT（5 mg/mL）后繼續(xù)孵育 1 h，采用酶標儀測定各孔570 nm處吸光度（OD值）。2）流式細胞檢測細胞凋亡：將不同處理方法干預后24 h的VSMC細胞接種于96孔板中，用1×Binding buffer配制成1×106個/mL的細胞懸液。分別加入5 μL Annexin V和10 μL的PI溶液染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。3）Western blotting檢測細胞中蛋白的表達：各組細胞經處理48 h后，用PBS沖洗2次，加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉移至0.22 μm PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗滌5次，加入HRP標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h?；瘜W發(fā)光試劑顯影后，凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖片并分析各蛋白條帶灰度值。4）RT-PCR檢測miRNA-99a的表達：各組細胞經處理48 h后，Trizol一步法提取總RNA，經純化、定量后逆轉錄合成cDNA，采用SYBR Green I real-time PCR檢測mRNA的相對表達量。引物設計如下（上海生工公司合成）：miRNA-99a上游5′-CATTACTAAACCCGTAGATCCGAT-3′；下游 5′-TAT GGTTTTGACGACTGTGTGAT-3′；U6 上 游 5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3′；下游 5′-GGAACGC TTCACGAATTTG-3′。PCR循環(huán)條件為 95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。以U6作為內參，并采用2-△△CT法分析miRNA-99a的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。各組數據以（±s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性檢驗，則組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組VSMC細胞增殖情況的比較 見表1。ox-LDL刺激后的VSMC細胞增殖能力顯著增加，4個時間段與空白組比較，差異均具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；miRNA-99a inhibitor組中VSMC細胞增殖能力顯著增加，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而SAEE組與miRNA-99a mimics組均能顯著抑制VSMC細胞增殖，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 各組VSMC細胞凋亡率的比較 見表2，圖1。模型組中VSMC細胞凋亡率顯著增加，其中早期凋亡與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而晚期凋亡和總凋亡率與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；miRNA-99a inhibitor組中晚期凋亡和總凋亡率亦顯著增加，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。SAEE組與miRNA-99a mimics組均能顯著抑制VSMC細胞凋亡，其中以晚期凋亡和總凋亡率顯著，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），早期凋亡與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組VSMC細胞增殖情況的比較（吸光度值，x±s）

表1 各組VSMC細胞增殖情況的比較（吸光度值，x±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 24 h 48 h 72 h 96 h 0.34±0.11 0.68±0.12 1.08±0.23 1.43±0.18 0.51±0.06△△ 1.07±0.13△△ 1.52±0.23△△ 2.02±1.10△△0.37±0.03**0.72±0.10**1.08±0.18** 1.45±0.23**miRNA-99a mimics組 6 0.40±0.03**0.79±0.11**1.14±0.13**1.52±0.17**miRNA-99a inhibitor組 6 0.64±0.06**1.32±0.23**1.86±0.15**2.44±0.29**

表2 各組VSMC細胞凋亡率的比較（%，x±s）

表2 各組VSMC細胞凋亡率的比較（%，x±s）

組別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6總凋亡率 早凋 晚凋6.64±1.08 1.96±0.03 4.68±1.10 11.66±1.60△△ 1.94±0.08 9.71±1.59△△6.98±1.28**2.04±0.12 4.94±1.18**miRNA-99a mimics組 6 8.72±1.01**2.04±0.09 6.68±1.02**miRNA-99a inhibitor組 6 14.03±1.42**1.86±0.09 12.17±1.40**

圖1 各組VSMC細胞的流式凋亡結果

2.3 各組VSMC細胞中 Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達的比較 見表3，圖2。模型組中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表達及Bax/Bcl-2的比值顯著增加，Bcl-2蛋白的表達顯著降低，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）；SAEE 組與 miRNA-99a mimics組中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表達及Bax/Bcl-2的比值顯著降低，Bcl-2蛋白的表達顯著增加，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01），miRNA-99a inhibitor組中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表達及Bax/Bcl-2的比值顯著增加，Bcl-2蛋白的表達顯著降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表3 各組VSMC細胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達的比較（x±s）

表3 各組VSMC細胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達的比較（x±s）

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 Bcl-2 β-actinBax/Bcl-2 1.23±0.24 0.18±0.03 0.55±0.11△△ 1.69±0.43△△1.03±0.19**0.33±0.07**miRNA-99a mimics組 6 0.77±0.11** 0.76±0.25** 0.44±0.05** 0.89±0.11**0.50±0.09**miRNA-99a inhibitor組 6 1.50±0.23** 2.01±0.40** 1.21±0.26** 0.30±0.04**4.05±0.89**Ki-67 β-actin PCNA β-actin Bax β-actin 0.30±0.09 0.37±0.10 0.22±0.03 1.12±0.27△△ 1.41±0.28△△ 0.90±0.15△△0.58±0.14** 0.62±0.15** 0.34±0.04**

圖2 各組VSMC細胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達的比較

2.4 各組VSMC細胞中MMP-1、TIMP-1蛋白表達的比較 見表4。模型組中MMP-1蛋白的表達及MMP-1/TIMP-1的比值顯著增加，TIMP-1蛋白的表達顯著降低，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；SAEE組與miRNA-99a mimics組中MMP-1蛋白的表達及MMP-1/TIMP-1的比值顯著降低，TIMP-1蛋白的表達顯著增加，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01），miRNA-99a inhibitor組中 MMP-1 蛋白的表達及MMP-1/TIMP-1的比值顯著增加，TIMP-1蛋白的表達顯著降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表4 各組VSMC細胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表達的比較（x±s）

表4 各組VSMC細胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表達的比較（x±s）

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 MMP-1 β-actin TIMP-1 β-actin MMP-1/TIMP-1 0.39±0.06 1.01±0.18 0.39±0.05 1.24±0.22△△ 0.49±0.14△△ 2.76±1.05△△0.62±0.12** 1.14±0.27** 0.59±0.23**miRNA-99a mimics組 6 0.70±0.23** 0.85±0.09** 0.83±0.28**miRNA-99a inhibitor組 6 1.53±0.22** 0.22±0.03** 7.25±1.27**

圖3 各組VSMC細胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表達的比較

2.5 各組VSMC細胞中miRNA-99a表達的比較 見表5。與空白組比較，模型組中miRNA-99a的表達顯著降低（P＜0.01）；SAEE能夠顯著增加VSMC細胞中miRNA-99a的表達，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與 miRNA-99a mimics作用相同，與miRNA-99a inhibitor作用相反。

表5 各組VSMC細胞中miRNA-99a表達的比較（x±s）

表5 各組VSMC細胞中miRNA-99a表達的比較（x±s）

組 別 n空白組 6模型組 6 SAEE組 6 miRNA-99a的相對表達量1.03±0.08 0.57±0.11△△3.09±0.15**miRNA-99a mimics組 6 3.58±0.40**miRNA-99a inhibitor組 6 0.24±0.04**

3 討 論

脈粥樣硬化形成的初期，低密度脂蛋白匯集于斑塊的中央部位，其內的不飽和脂肪酸在自由基和其他致氧因素作用下，經過一系列的氧化和修飾過程，最后形成 ox-LDL［5］。 ox-LDL 能夠通過刺激 VSMC、內皮細胞和巨噬細胞釋放多種趨化因子和炎性因子，是促進斑塊的形成和失穩(wěn)的關鍵［6］。本研究采用ox-LDL刺激的方式復制VSMC模型，能夠更加可靠地反映動脈粥樣硬化形成及失穩(wěn)過程中的病理變化。

VSMC的增殖能夠引起內膜增厚和斑塊形成，是管腔狹窄和動脈粥樣硬化的病理學基礎。Ki-67與細胞的有絲分裂過程密切相關，是目前公認的檢測細胞增殖活性的重要標志物［7］。作為DNA復制過程和細胞增殖的關鍵標志物之一，PCNA是一種分子量為36KD的DNA聚合酶δ的輔助蛋白，主要存在于細胞核內，在調控細胞周期、DNA損傷修復和甲基化的過程中發(fā)揮著重要的作用［8］。雖然VSMC的凋亡能在一定程度上抗衡增殖引起的斑塊形成，但是近年來大量的研究發(fā)現，細胞凋亡亦與動脈粥樣硬化的生成和穩(wěn)定性密切相關［9］。 VSMC 的凋亡能夠導致 IL-8、IL-1α 等細胞因子的釋放，促進巨噬細胞的浸潤和加重斑塊內的炎癥反應，令斑塊失穩(wěn)；同時，晚期凋亡的VSMC能夠增加凝血酶的合成和局部凝血酶的活性，促進血栓形成［10］。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的主要成分，其能夠阻止線粒體細胞色素C釋放發(fā)揮抗凋亡的作用［11］。Bax作為Bcl-2家族的前凋亡蛋白，能夠促進線粒體釋放細胞色素C和促進內質網中鈣離子的釋放，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用進而促進細胞凋亡［12］。

細胞外基質（ECM）是構成動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的主要成分之一［13］。ECM的合成、降解和成分的穩(wěn)定，取決于MMP和基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）之間的動態(tài)平衡。在生理狀態(tài)下MMP-1處于低濃度水平，而在炎癥因子的刺激下MMP-1的分泌持續(xù)增加，TIMP-1能夠結合MMP-1形成非共價的復合物，限制其降解膠原的作用［14］。在本研究中我們發(fā)現，SAEE能顯著抑制VSMC細胞增殖和晚期凋亡，降低細胞中Ki-67、PCNA、Bax、MMP-1 蛋白的表達及 Bax/Bcl-2、MMP-1/TIMP-1的比值，增加Bcl-2和TIMP-1蛋白的表達，說明SAEE具有促進斑塊的穩(wěn)定和防止斑塊的脫落或破裂的作用，其作用機制是通過調控VSMC細胞增殖、凋亡和細胞外基質的合成、降解實現的。

近年來大量的的研究表明，MicroRNA在動脈硬化的發(fā)生與發(fā)展過程中，發(fā)揮著重要的作用［15］。其中miRNA-99a能夠通過抑制IGF-1R and mTOR信號通路的活化，從而抑制VSMC的增殖，延緩動脈硬化的發(fā)生與發(fā)展［16］。本研究結果顯示，SAEE能夠顯著增加VSMC細胞中miRNA-99a的表達，與miRNA-99a mimics組結果相同，與miRNA-99a inhibitor結果相反，因此我們推斷SAEE調控VSMC細胞增殖、凋亡和ECM的合成、降解的作用，可能是通過上調細胞中miRNA-99a的表達實現的。

綜上所述，SAEE能夠抑制VSMC細胞增殖、凋亡和細胞外基質的降解，促進斑塊的穩(wěn)定和防止纖維帽的破裂，其作用機制是通過上調細胞中miRNA-99a的表達實現的。