師小徑 鄭明奮 萬仁強(qiáng) 張沈華

[摘要] 目的 探討紫杉醇對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞體外自噬的影響。 方法 體外培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2，采用MTT法檢測(cè)紫杉醇對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞系CEN2的增殖抑制，分析紫杉醇對(duì)CEN2細(xì)胞凋亡的影響;觀察并分析藥物作用后鼻咽癌細(xì)胞周期變化及紫杉醇對(duì)CNE2細(xì)胞的放射增敏作用。 結(jié)果 加藥12 h后，存活細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組（P < 0.05）;加藥48 h后，存活細(xì)胞比例明顯低于其他組（P < 0.05）;加藥24 h后，早期凋亡細(xì)胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）;加藥48 h后，細(xì)胞壞死和晚期凋亡細(xì)胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）。在整個(gè)細(xì)胞周期中，空白對(duì)照組G0/G1周期占比最高，同時(shí)明顯高于其他組（P < 0.05）;單純紫杉醇組G2/M周期占比最高，同時(shí)明顯高于其他組（P < 0.05）;單純放療組G0/G1、G2/M和S周期的占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;紫杉醇+放療組G2/M周期占比例最高（P < 0.05）。其中紫杉醇+放療組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組（P < 0.05）。 結(jié)論 紫杉醇對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞有明顯的毒性作用，能抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞的分裂，可一定程度上治療鼻咽癌。隨著紫杉醇濃度的增加，其對(duì)CNE2細(xì)胞的凋亡作用越強(qiáng)。紫杉醇聯(lián)合放療治療可進(jìn)一步提高CNE2細(xì)胞的凋亡率。

[關(guān)鍵詞] 紫杉醇;鼻咽癌;細(xì)胞自噬

[中圖分類號(hào)] R739.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）03（c）-0022-04

ct] Objective To investigate the effect of Paclitaxel on autophagy in human nasopharyngeal carcinoma cells in vitro. Methods Human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 was cultured in vitro. The proliferation inhibition of Paclitaxel on human nasopharyngeal carcinoma cell line CEN2 was detected by MTT assay. The effect of Paclitaxel on CEN2 cell apoptosis was analyzed. The cell cycle changes and radiosensitization of Paclitaxel on CNE2 cell were observed and analyzed. Results After 12 h of treatment， the proportion of surviving cells was significantly lower than that of the control group （P < 0.05）; after 48 h of treatment， the proportion of surviving cells was significantly lower than that of other groups （P < 0.05）; after 24 h of treatment， the proportion of early apoptotic cells was the highest， significantly higher than that of other groups （P < 0.05）; after 48 h of treatment， the proportion of cell necrosis and late apoptotic cells was the highest， significantly higher than that of other groups （P < 0.05）. In the whole cell cycle， the proportion of G0/G1 cycle in blank control group was the highest， and significantly higher than that in other groups （P < 0.05）; the proportion of G2/M cycle in paclitaxel group was the highest， and significantly higher than that in other groups （P < 0.05）; there was no significant difference in the proportion of G0/G1， G2/M and S cycle in radiotherapy group （P > 0.05）; and the proportion of G2/M cycle in paclitaxel + radiotherapy group was the highest （P <0.05）. The apoptotic rate of paclitaxel + radiotherapy group was significantly higher than that of other groups （P < 0.05）. Conclusion Paclitaxel has obvious toxic effects on human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， which can inhibit the division of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， and can treat nasopharyngeal carcinoma to some extent. As the concentration of paclitaxel increases， its apoptosis effect on CNE2 cells is stronger. Paclitaxel combined with radiotherapy can further increase the apoptosis rate of CNE2 cells.

[Key words] Paclitaxel; Nasopharyngeal carcinoma; Cell autophagy

放化療聯(lián)合治療是臨床治療頭面部腫瘤的主要方式之一，能降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，提高患者的生活質(zhì)量水平[1]。但其對(duì)腫瘤患者的生存率并無明顯改善。腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者生存期的重要因素[2]，如何有效局部控制腫瘤一直廣受臨床醫(yī)師重視和關(guān)注。化療具有增敏放射治療的作用，藥物化療增加了放療的敏感性，增強(qiáng)了放療治療效果[3]。如今臨床上化療藥物較多，包括5-氟尿嘧啶、順鉑、羥基脲、阿霉素等，均能有效提高放療的效果[4]。雖然放射治療提高了化療藥物治療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，但正常細(xì)胞也會(huì)受到相應(yīng)的損傷[5]。鼻咽癌在臨床上較為常見，一般多采用放療進(jìn)行治療。大多數(shù)放化療主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤進(jìn)一步發(fā)展。近年來，細(xì)胞自噬在腫瘤治療方面發(fā)揮出積極作用。自噬是細(xì)胞降解細(xì)胞器的唯一途徑，是腫瘤細(xì)胞生存所必需的過程。但在某些情況下，持續(xù)、過度自噬可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，實(shí)現(xiàn)滅殺腫瘤細(xì)胞的效果[6]。紫杉醇是臨床常用的化療藥物，具有廣泛的抗癌譜。本研究通過探討紫杉醇對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞體外自噬的影響，以期為臨床化療聯(lián)合放療鼻咽癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所有鼻咽癌CNE2細(xì)胞均由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科提供。

1.2 儀器與試藥

1.2.1儀器? 高速低溫離心機(jī)（美國(guó)BeckmanGS-15R公司）;流式細(xì)胞儀（BD）（日本Shmadzu公司）。

1.2.2 試劑? 紫杉醇（法國(guó)Sanofi-Aventis公司）;胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司）;胰酶（美國(guó)Sigma公司）。

1.3 試劑配制

1.3.1 RPMI-1640培養(yǎng)液? 取1640干粉型培養(yǎng)基置于恰當(dāng)容器，三蒸水溶解，加入1.6 g NaHCO3干粉以及2.38 g HEPES干粉。將所配制的試劑放于離心機(jī)上進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，時(shí)間30 min，以保證培養(yǎng)基中的干粉溶解完全。將預(yù)先配制好的鹽酸溶液緩慢滴入培養(yǎng)液中，攪勻，使pH值調(diào)整為7.2～7.4，定容1000 mL，微孔濾過膜濾菌，微孔直徑0.22 μm。加入胎牛血清配置成10%胎牛血清培養(yǎng)液，備用。

1.3.2 PBS緩沖液? 在燒杯中分別加入0.2、0.2、2.9、8.0 g的KCl、KH2PO4、NaH2PO4、NaCl，加入三蒸水至1000 mL，將pH值調(diào)至7.2，高壓滅菌并在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 0.25%胰蛋白酶溶液? 將0.25 g胰蛋白酶加入100 mL三蒸水溶解，pH調(diào)至7.0，4℃過夜，次日濾菌，配制成0.25%胰蛋白酶溶液。

1.3.4 凍存液? 取PRMI-1640培養(yǎng)液7 mL、胎牛血清2 mL以及DMSO 1 mL混合，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MTT溶液? 25 mg MTT干粉加入磷酸緩沖鹽（PBS）溶液5 mL，充分?jǐn)嚢?0 min，4℃保存。提取保存在液氮罐中的CNE2細(xì)胞，37℃水浴解凍并吸出懸浮細(xì)胞，將10 mL PRMI-1640溶液加入裝有細(xì)胞懸液的離心管中。1000 r/min離心5 min，去除上清液，漂洗離心培養(yǎng)基后，加入培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液覆蓋瓶底，37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋瓶底70%時(shí)可傳代。PBS洗滌兩次，加入0.2 mL胰酶，顯微鏡下若觀察到細(xì)胞固縮，則立刻停止消化，加入3 mL培養(yǎng)液，敲打時(shí)瓶底細(xì)胞脫落。分裝細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)液至5 mL，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.6 紫杉醇培養(yǎng)基? 逐步稀釋含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基至各濃度。

1.4 MTT法檢測(cè)紫杉醇對(duì)CNE2細(xì)胞的毒性作用及IC50

①取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CEN2細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液1×105/mL;②取96孔板，分別加入200 μL單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng);③CEN2細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的紫杉醇培養(yǎng)液，濃度分別為0.015、0.06、0.25、1、4、16、64 μg/mL。每個(gè)濃度均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，對(duì)照組加入生理鹽水作為對(duì)照;④其后，37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，去除陳舊培養(yǎng)基及藥物;⑤每孔加入20 μL MTT溶液，再次孵育4 h;⑥去除MTT溶液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液，振蕩10 min;⑦在490 nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)量OD值;⑧根據(jù)所測(cè)OD值計(jì)算紫杉醇對(duì)CEN2細(xì)胞的抑制率和IC50。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同紫杉醇濃度及作用不同時(shí)間對(duì)CNE2細(xì)胞凋亡的影響

1.5.1 AnnexinV/PI雙雜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紫杉醇對(duì)CNE2細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用? ①于6孔板中種植CNE2細(xì)胞，分為加藥12 h組、加藥24 h組、加藥48 h組，待細(xì)胞貼壁后加入4 μg/mL紫杉醇;②于加入紫杉醇12、24、48 h后收集細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，1000 r/min旋轉(zhuǎn)離心5 min，后棄上層血清。PBS溶液洗滌3次;③將細(xì)胞重懸，加入200 μL緩沖液，細(xì)胞密度調(diào)至1×106個(gè)/mL;④取195 μL細(xì)胞懸液加至AnnexinV-FITC溶液5 μL混勻，避光放置10 min;⑤結(jié)合緩沖液進(jìn)行清洗，采用離心機(jī)，1000 r/min旋轉(zhuǎn)離心5 min，后棄去上清液，重新懸浮于190 μL配好的緩沖液中;⑥加入10 mL PI（20 μg/mL），室溫下避光孵育5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5.2 紫杉醇對(duì)CNE2細(xì)胞凋亡率和周期的影響? ①細(xì)胞分組：將CNE2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、單純紫杉醇組、單純放療組以及紫杉醇+放療組（放療方法：鼻咽部治療采用6 mV光子線照射，劑量72～76 Gy，照射36～38次，治療8周。）;②接種CNE2細(xì)胞于6孔板上，等待細(xì)胞貼壁;③待CNE2細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞懸浮、消化、洗滌、離心;④采用70%乙醇固定，-20℃保存;⑤再取1×106個(gè)細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，3 mL PBS懸浮細(xì)胞;⑥400目篩網(wǎng)過濾，1000 r/min離心5 min，棄除PBS;⑦加入PI染液和RNA酶各1 mL，4℃下避光反應(yīng)30 min;⑧流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

所有實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次，取平均值，觀察紫杉醇作用不同時(shí)間對(duì)CNE2細(xì)胞的影響以及紫杉醇和放療對(duì)CNE2細(xì)胞周期分布的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇作用不同時(shí)間對(duì)CNE2細(xì)胞的影響

加藥12 h和加藥24 h后存活細(xì)胞明顯低于對(duì)照組，加藥48 h后存活細(xì)胞比例明顯低于其他組（均P < 0.05）;加藥24 h早期凋亡細(xì)胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）;加藥48 h細(xì)胞壞死和晚期凋亡細(xì)胞比例最高，明顯高于其他組（P < 0.05）。見表1。

2.2 紫杉醇和放療對(duì)CNE2細(xì)胞周期分布的影響

在整個(gè)周期中，空白對(duì)照組G0/G1周期的占比最高，同時(shí)明顯高于其他組（P < 0.05）。單純紫杉醇組G2/M周期占比最高，同時(shí)明顯高于其他組（P < 0.05）。單純放療組G0/G1、G2/M和S周期的占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。紫杉醇+放療組G2/M周期占比最高（P < 0.05）。其中，紫杉醇+放療組凋亡率明顯高于其他組（P < 0.05）。見表2。

3 討論

鼻咽癌在臨床上較為常見，臨床主要采用放療法進(jìn)行治療，放療聯(lián)合化療是臨床治療鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)方案[7]。雖然放療技術(shù)和設(shè)備在不斷進(jìn)步，但鼻咽癌患者預(yù)后生存率仍然不高[8]。

近年來，隨著紫杉醇在臨床上的廣泛應(yīng)用，其對(duì)各種惡性腫瘤的放化療起到了促進(jìn)作用[9]。報(bào)道[10]顯示，紫杉醇聯(lián)合順鉑以及5-氟尿嘧啶進(jìn)行化療，其化療效果相對(duì)于順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶更顯著，且細(xì)胞毒性反而更低。而其他研究[11]中也報(bào)道，紫杉醇在治療鼻咽癌中具有良好效果。

紫杉醇是一種植物類抗癌藥，由太平洋紫杉樹的樹皮和針葉中提取而出，具有抗癌作用[12]。其作用與細(xì)胞骨架的維管系統(tǒng)，通過與β-微管蛋白氨基酸的結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，阻斷細(xì)胞周期G2/M期干擾細(xì)胞分裂，從而促進(jìn)放療效果[13-14]。本研究采用紫杉醇對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察不同濃度紫杉醇以及紫杉醇和放療對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，紫杉醇濃度越高，存活細(xì)胞比例越低，而壞死和晚期凋亡細(xì)胞比例明顯升高。提示紫杉醇具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其濃度升高時(shí)，紫杉醇對(duì)CEN2細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用。紫杉醇作用12 h，即出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;紫杉醇作用24 h，早期凋亡最明顯;紫杉醇作用48 h，早期凋亡降低，但CNE2大量壞死和晚期凋亡，可見紫杉醇對(duì)CNE2細(xì)胞具有明顯抑制作用，早期主要為細(xì)胞凋亡，晚期為細(xì)胞壞死。細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[15]。目前認(rèn)為可能引起腫瘤的原因[16]為：①可誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞基因的失活，導(dǎo)致凋亡基因表達(dá)水平較高;②機(jī)體免疫導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡功能喪失;③宿主細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。而紫杉醇引起鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與紫杉醇影響細(xì)胞內(nèi)各蛋白的表達(dá)有關(guān)。王娜等[17]的研究顯示，Bcl-2、Bax、Cox-2、Cyclin-D1及Caspase-3等基因表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞凋亡功能有密切關(guān)系。

還有研究[18]顯示，紫杉醇對(duì)腫瘤放療具有增敏作用，但目前紫杉醇對(duì)腫瘤放療的增敏作用機(jī)制尚未完全明確。部分學(xué)者[19]認(rèn)為這可能與紫杉醇抑制了放療后引起的細(xì)胞潛在性致死損傷修復(fù)功能有關(guān)。大部分學(xué)者更偏向與細(xì)胞不同周期對(duì)射線敏感性不同的理論[20]。在細(xì)胞周期中以G2/M期為最敏感的時(shí)期，S期為最不敏感期。通常認(rèn)為將細(xì)胞滯留與G2/M期是放療效果最好的時(shí)期。本研究發(fā)現(xiàn)，單純紫杉醇作用的CNE2細(xì)胞停留在G2/M期的比例高達(dá)80%，提示紫杉醇具有漿細(xì)胞阻滯在G2/M期的作用，從而增加細(xì)胞對(duì)射線的敏感程度，提高放療效果。紫杉醇聯(lián)合放療治療后，細(xì)胞凋亡率高達(dá)55.62%，明顯高于其他組，也進(jìn)一步提示紫杉醇對(duì)放療具有增敏作用，提高了放療對(duì)CNE2細(xì)胞的殺傷力，從而達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的效果。

綜上所述，紫杉醇對(duì)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用和抑制分裂效果，可一定程度上起到治療鼻咽癌的作用。隨著紫杉醇濃度的增加，其對(duì)CNE2細(xì)胞的凋亡作用越強(qiáng)。紫杉醇聯(lián)合放療治療可進(jìn)一步提高CNE2細(xì)胞的凋亡率。

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（收稿日期：2018-02-09? 本文編輯：王? ?蕾）