溫海霞 肖曉輝 孟毅 程丹玲

[摘要] 目的 觀察Genistein對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）基因表達(dá)的影響及其與雌激素受體（ER）的關(guān)系。 方法 分離大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別給予Genistein（0.1、1、5、10、100 μmol/L）及ER阻斷劑ICI182，780（1 μmol/L）處理24 h后，采用RT-PCR檢測CREB mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1、5和10 μmol/L Genistein組CREB mRNA表達(dá)顯著高于空白對照組（P < 0.05或P < 0.01）。細(xì)胞預(yù)先加入ER阻斷劑ICI182，780處理30 min后，再加入1、10 μmol/L Genistein處理24 h組，CREB mRNA表達(dá)與1、10 μmol/L Genistein組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 1～10 μmol/L的Genistein可上調(diào)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CREB基因的表達(dá)，但可能并非通過ER介導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞] Genistein;卵巢顆粒細(xì)胞;cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白;雌激素受體

[中圖分類號] R339.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（c）-0019-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of Genistein on the gene expression of cAMP response element binding protein （CREB） in the rats ovarian granulosa cells and the relationship with the estrogen receptor （ER）. Methods The ovarian granulosa cells from female rat were isolated and collected， incubated and treated with Genistein （0.1， 1， 5， 10， 100 μmol/L） and ER blocker ICI182， 780 （1 μmol/L） for 24 h. Then the CREB mRNA expression level was assessed by RT-PCR. Results Compared with the control group， the expression of CREB mRNA of 1， 5 and 10 μmol/L Genistein group was higher （P < 0.05 or P < 0.01）. After the cells pretreated with ER blocker ICI182， 780 for 30 min， 1， 10 mol/L Genistein added and pretreated 24 h group， the expression of CREB mRNA had no significant difference compared with the 1， 10 μmol/L Genistein group （P > 0.05）. Conclusion 1-10 μmol/L Genistein could up-regulate the expression of CREB gene in the rats ovarian granulosa cells. The molecular mechanism of Genistein effect on the CREB gene expression may not be mediated by ER.

[Key words] Genistein; Ovarian granulosa cells; cAMP response element binding protein; Estrogen receptor

Genistein是一種植物雌激素，具有強(qiáng)抗氧化性和多重腫瘤抑制效應(yīng)[1-3]，并能雙向調(diào)節(jié)雌激素受體（estrogen receptor，ER）[4-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，Genistein可誘導(dǎo)芳香化酶基因轉(zhuǎn)錄，增加局部雌激素合成。在卵巢顆粒細(xì)胞，芳香化酶的活性主要受卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）調(diào)節(jié)[8]，后者通過FSHR-AC-cAMP-PKA途徑，激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB），進(jìn)而始動芳香化酶基因轉(zhuǎn)錄[9-10]。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的Genistein可影響卵巢顆粒細(xì)胞芳香化酶基因表達(dá)，但是否經(jīng)由ER介導(dǎo)，并進(jìn)而影響CREB轉(zhuǎn)錄，目前尚不清楚。因此，本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄PCR等分子生物學(xué)技術(shù)，觀察Genistein對雌性大鼠的卵巢中顆粒細(xì)胞CREB基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步使用ER-α的阻斷劑ICI182，780觀察Genistein上述作用與ER的關(guān)系，初步揭示Genistein調(diào)節(jié)卵巢局部內(nèi)分泌功能的分子機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康雌性SD大鼠，25～28 d齡，體重60～80 g，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供，自動控制光照，自由攝食、飲水。實驗動物使用許可證號：（黑）2013-002。

1.2 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀（PTC-100型，美國MJ.Research公司）;GIS凝膠成像及分析系統(tǒng)（上海天能生物公司）。

1.3 主要試劑

Genistein（美國Sigma公司）;17β-雌二醇（17β-E2，美國Sigma）;ICI182，780（美國Sigma）;小牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma）;孕馬血清促性腺激素（PMSG，天津華孚高新生物技術(shù)公司）;Trizol（美國Invitrogen公司）;BcaBESTTM RNA PCR試劑盒（大連Takara Nilestriol公司）;PCR引物（上海英駿生物有限公司）。

1.4 實驗分組及處理

未成年大鼠頸后皮下注射PMSG，60 U/只，48 h后急性斷頭處死，立刻剝離出雙側(cè)卵巢，針刺卵泡充分釋放出顆粒細(xì)胞，過濾、沖洗、離心后，用新鮮配制的DMEM/F12培養(yǎng)液（含青、鏈霉素）調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/mL。細(xì)胞懸液分裝至6孔培養(yǎng)板，37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，分別加入不同濃度Genistein（GEN）、17β-E2及ICI182，780（ICI）等因素處理。

實驗共分9組：①空白對照組（0 μmol/L GEN組）;②0.1 μmol/L GEN組;③1 μmol/L GEN組;④5 μmol/L GEN組;⑤10 μmol/L GEN組;⑥100 μmol/L GEN組;⑦17β-E2（10 nmol/L）組;⑧1 μmol/L ICI預(yù)處理30 min后加1 μmol/L GEN組;⑨1 μmol/L ICI預(yù)處理30 min后加10 μmol/L GEN組。因素處理細(xì)胞24 h后，收集至1.5 mL Eppendorf管中，-70℃保存，用于總RNA提取和RT-PCR。見表1。

1.5 實驗方法

利用RT-PCR技術(shù)檢測CREB mRNA表達(dá)。先使用Trizol提取細(xì)胞總的RNA，按PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄。利用Gene Runner軟件進(jìn)行設(shè)計引物，β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1 min，94℃變性4 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)為38次，72℃充分延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行條帶灰度分析，以目標(biāo)基因CREB與內(nèi)參β-actin灰度的比值代表CREB的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。CREB及β-actin的引物序列及產(chǎn)物長度見表2。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CREB mRNA的表達(dá)情況

通過逆轉(zhuǎn)錄PCR電泳及成像結(jié)果顯示，實驗各組均擴(kuò)增出一條CREB片段，大小約256 bp。

2.2 Genistein對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CREB mRNA表達(dá)的影響

電泳條帶的灰度分析顯示：1、5和10 μmol/L Genistein組及10 nmol/L 17β-E2組CREB mRNA表達(dá)量與空白對照組比較均明顯增加（P < 0.05或P < 0.01）。細(xì)胞預(yù)先加入ER阻斷劑ICI182，780培養(yǎng)30 min后，再分別加入1 μmol/L和10 μmol/L Genistein繼續(xù)處理細(xì)胞24 h，H組與D組、I組和F組比較，CREB mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，Genistein可增加人卵巢癌細(xì)胞A2780對順鉑等常規(guī)化療藥物的敏感性[10]，并能調(diào)節(jié)雌性哺乳動物內(nèi)分泌活動[11-13]。本研究[14-16]前期在體實驗也發(fā)現(xiàn)，Genistein可上調(diào)衰老大鼠卵巢ER-α表達(dá)，并促進(jìn)雌激素生成關(guān)鍵酶芳香化酶基因表達(dá)，但具體機(jī)制尚不十分清楚。

CREB是細(xì)胞內(nèi)的第三信使，定位于細(xì)胞核內(nèi)，作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，可影響芳香化酶基因轉(zhuǎn)錄水平[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，Genistein能夠通過激活PKC和P38而促使DNA結(jié)合FSHR下游因子CREB和芳香化酶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究觀察了Genistein對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CREB mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)1、5、10 μmol/L Genistein作用顆粒細(xì)胞24 h，均可增加CREB mRNA表達(dá)，并且這種作用不被ER阻斷劑ICI182，780所抑制，提示Genistein對芳香化酶基因上游調(diào)控因子CREB的激活可能并非通過ER介導(dǎo)。

研究[20]發(fā)現(xiàn)，Genistein可影響子宮內(nèi)膜芳香化酶啟動子Ⅰ的表達(dá)，是通過一種新型膜性G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein coupled estrogen receptor，GPER）介導(dǎo)，與經(jīng)典ER無關(guān)。那么Genistein影響卵巢芳香化酶及上游CREB的表達(dá)是否經(jīng)由GPER介導(dǎo)，尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-10-21? 本文編輯：金? ?虹）