靳雯臻 譚曉川 文瑾 宋輝 張宇佳 鄭穩(wěn)生

[摘要] 肝纖維化是嚴重威脅人類健康的慢性疾病。由于藥物遞送缺乏靶向性，肝纖維化治療效果有限且常伴隨著副作用的發(fā)生。為提高肝纖維化治療效果，使用納米載體達到靶向遞送的研究越來越廣泛。本文從靶向目標及載體種類方面綜述了近年來靶向肝星狀細胞治療肝纖維化的納米遞送載體的研究進展，提供了肝纖維化靶向治療的新思路，為實現(xiàn)高效治療肝纖維化提供理論參考。

[關(guān)鍵詞] 肝纖維化;肝星狀細胞;納米載體;靶向遞送

[中圖分類號] R512.62? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（c）-0034-04

[Abstract] Hepatic fibrosis， a chronic disease， proposes a serious threat to human health. The low efficiency and occurrence of side effects are often contributed by the lack of liver specificity. In order to improve the therapeutic effect of liver fibrosis，research about the use of nanocarriers to achieve targeted delivery has become more and more extensive. This review summarizes the nano-delivery carriers targeting hepatic stellate cells that have been applied in the treatment of liver fibrosis in recent years from the type of carriers and target receptors，which offer a new idea to treat liver fibrosis and serve as the basis of designing safe and effective drug delivery systems for liber fibrosis.

[Key words] Hepatic fibrosis; Hepatic stellate cells; Nanocarrier; Target delivery

肝是人體最大的實質(zhì)器官，在人體膽固醇代謝和腸道脂質(zhì)吸收中發(fā)揮著極為重要的作用。慢性肝損傷包括病毒性肝炎感染、酒精濫用、脂肪性肝炎等均可引起肝臟炎性反應并延緩肝臟的傷口愈合過程，進而導致肝纖維化。肝纖維化的特征表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積累和纖維瘢痕形成。纖維瘢痕破壞正常的肝臟結(jié)構(gòu)并損傷肝細胞，阻礙肝臟正常生理功能的發(fā)揮，最終導致肝功能衰竭。然而，目前為止，除了去除潛在的病因和肝移植之外，仍沒有可用于肝纖維化治療的有效手段。

肝纖維化是由門靜脈成纖維細胞、骨髓衍生成纖維細胞、間質(zhì)細胞和活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）介導的ECM（主要是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原）合成和降解不平衡的結(jié)果。作為ECM的主要來源，肌成纖維細胞的活化和增殖在纖維化中是極為重要的。不同病因引起的肝纖維化中肌成纖維細胞的來源可能是不同的，但在肝纖維化的最后階段，HSC都將被活化并最終成為肌成纖維細胞群體[1]的最大貢獻者。已有研究顯示HSC的消耗會顯著減輕模型小鼠中的肝纖維化和肝損傷程度。

HSC定位于肝細胞和竇狀內(nèi)皮細胞之間的竇周間隙中，占正常肝臟中肝細胞數(shù)量的5%～8%[2]。正常肝臟中HSC是非實質(zhì)的靜止細胞，是體內(nèi)維生素A（Vitamin A，VA）儲存的主要部位[3]。在纖維化刺激如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）水平增加的影響下，VA水解提供能量，HSC活化為肌成纖維細胞并轉(zhuǎn)移至損傷部位，并在此處表達纖維化相關(guān)產(chǎn)物如波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和α平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）[4]。缺乏VA儲備的HSC同樣具有活化并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的能力。HSC聚集在受損組織周圍，并分泌化學物質(zhì)如單核細胞趨化蛋白，進一步吸引活化的HSC并促進單核細胞和白細胞的募集。HSC活化的另一個特點是細胞生長周期激活，導致HSC增殖且肝臟中肌成纖維細胞數(shù)量增加[5]。加速ECM產(chǎn)生的同時，HSC通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑抑制ECM的降解。多種因素的共同作用下，ECM在細胞外大量積累引起纖維化發(fā)生。

活化的HSC細胞表面表達或高表達多種受體，如甘露糖-6-磷酸/胰島素樣（mannose-6-phosphate/insulinlike growth factor Ⅱ，M6P/IGF Ⅱ）受體，整聯(lián)蛋白（integrin），血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptors，PDGFR），視黃醇結(jié)合蛋白（retinol binding protein，RBP）等。近年來納米載體發(fā)展迅速，利用制劑方法構(gòu)建靶向HSC的納米載體，遞送藥物抑制HSC活化是治療肝纖維化極有前景的方法?，F(xiàn)將研究進展綜述如下：

1 靶向M6P/IGF Ⅱ受體

M6P/IGF Ⅱ受體是一種多功能受體，肝纖維化期間，M6P/IGF Ⅱ受體在HSC表面過表達，并能促進TGF-β活化，而TGF-β是刺激HSC產(chǎn)生膠原的強效細胞因子。M6P/IGF Ⅱ受體總數(shù)的10%～20%存在于細胞表面[6]。甘露糖-6-磷酸修飾的人血清白蛋白（M6P-modified-human serum albumin，M6P-HSA）對M6P/IGF Ⅱ受體具有選擇性，可在活化的HSC中積累。HSC靶向遞送中，關(guān)于M6P/IGF Ⅱ受體的研究最為深入，大量數(shù)據(jù)均表明M6P-HSA與其結(jié)合靶向遞送的有效性。目前M6P-HSA已作為己酮可可堿、多柔比星、膠霉毒素[14]等藥物的靶向遞送。利用M6P/IGF Ⅱ受體與M6P-HSA的特異性識別并結(jié)合，以其為靶標，通過構(gòu)建的納米載體將藥物選擇性地遞送至HSC，實現(xiàn)肝纖維化的靶向給藥。

脂質(zhì)體是肝纖維化靶向遞送的主要載體。一項研究構(gòu)建證明將M6P-HSA偶聯(lián)至脂質(zhì)體能極大程度地增強其HSC結(jié)合攝取率。該研究中發(fā)現(xiàn)M6P-HSA修飾的脂質(zhì)體靜脈注射10 min后即有90%的載體從體循環(huán)中清除靶向至HSC[8]，保證了其能將負載的藥物高效地遞送至HSC中。Luk等[9]的研究證明，將M6P-HSA偶聯(lián)到載有18β-甘草次酸的脂質(zhì)體表面能顯著減弱模型大鼠的纖維化程度。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ可阻止PDGF介導的增殖和遷移，抑制α-SMA的表達。一項研究以薄膜水化法構(gòu)建了過氧化物酶體增殖物激活受體-γ配體負載的脂質(zhì)體并偶聯(lián)以M6P-HSA。靜脈給藥后發(fā)現(xiàn)，模型小鼠纖維化癥狀明顯減輕，藥物分布及藥效學數(shù)據(jù)表明修飾后肝臟攝取增加2.61倍[10]。M6P-HSA修飾的脂質(zhì)體還可將滅活病毒靶向遞送至HSC[11]。研究者以該載體負載包含質(zhì)粒DNA的日本滅活病毒獲得粒徑為200 nm的脂質(zhì)體，M6P-HSA保證了載體的HSC靶向，脂質(zhì)體與病毒包膜的融合則使滅活病毒顆粒在HSC中積累成為現(xiàn)實。這項研究的重要意義在于其有潛力聯(lián)合遞送基因編輯系統(tǒng)至HSC，使得肝纖維化的治療進入新的領(lǐng)域。

膠束是另一個常見載體。Hedgehog信號可調(diào)節(jié)膽汁淤積性肝臟缺血再灌注期間的肝損傷，使用Smo抑制劑環(huán)巴胺阻斷其通路能有效發(fā)揮肝保護作用。肝纖維化發(fā)生時，反復的肝損傷會造成肝實質(zhì)細胞增加分泌生長因子及Hedgehog配體，進而導致HSC轉(zhuǎn)化為活性肌成纖維細胞。環(huán)巴胺GDC-0449在肝纖維化大鼠中可通過降低HSC活化和抑制上皮至間質(zhì)的轉(zhuǎn)化減弱肝纖維化的程度。有研究[12]構(gòu)建能生物降解的長循環(huán)聚合物膠束并綴合以M6P。在給未修飾載藥膠束后，正常及模型大鼠中主藥均快速清除，表現(xiàn)出相似的血漿清除率和AUC。而靜脈給靶向載體后GDC-0449表現(xiàn)出更高肝積累并達到最大。這表明經(jīng)M6P修飾的膠束可用作肝纖維化治療的理想遞送載體。

新型納米粒也越來越引起研究者的關(guān)注。已有研究證明，人血清和牛血清白蛋白納米粒能靶向HSC治療肝纖維化。雄性Wistar大鼠體內(nèi)外研究均表明M6P修飾的人血清白蛋白納米粒是一種有效的納米載體，能特異性靶向HSC并利用免疫反應發(fā)揮纖維化治療作用[13]。另一組研究使用M6P修飾人血清蛋白納米粒成功將多柔比星遞送至HSC，體內(nèi)外研究均顯示出肝纖維化標志物的減少。

2 靶向整聯(lián)蛋白

整聯(lián)蛋白是許多器官纖維化的中樞調(diào)節(jié)劑。所有整聯(lián)蛋白在其配體中有共同的基序，其中RGD（Arg-Gly-Asp）序列研究最為廣泛。RGD易于被疊氮化物、胺或其他氨基酸和熒光基團等修飾而具有不同的特異性[14]，RGD修飾的白蛋白或脂質(zhì)體能有效靶向遞送藥物至HSC。

Chai等[15]制備了RGD修飾的氧化苦參堿脂質(zhì)體，通過靶向HSC抑制其活性并誘導細胞凋亡發(fā)揮抗纖維化效果。數(shù)據(jù)顯示，給RGD修飾脂質(zhì)體治療的纖維化大鼠的血清堿性磷酸酶的能力增加顯著，纖維化程度明顯減輕。干擾素α具有抗纖維化作用，皮下給藥可有效降低模型大鼠的基因表達及Ⅰ型和Ⅲ型膠原沉積。有研究構(gòu)建了RGD修飾空間穩(wěn)定脂質(zhì)體。RGD與活化的HSC表現(xiàn)出高親和力，在HSC中的積累量高達未標記脂質(zhì)體的10倍。HSC增殖受到抑制，Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA表達量明顯降低，且注射靶向載體的模型大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素水平降低。結(jié)果表明，RGD標記脂質(zhì)體通過受體介導的內(nèi)吞作用被活化的HSC選擇性吸收，并且包封脂質(zhì)體制劑中的干擾素在體外顯示出對HSC增殖的更好抑制。該脂質(zhì)體制劑代表了一種靶向藥物載體用于治療肝纖維化的新方法，并且它可能具有潛在的臨床應用[16]。

聚合物囊泡是由兩親性片段組成的自組裝載體，可負載親水及疏水性藥物。聚合物囊泡的理化性質(zhì)如粒徑、載藥量、表面改性以及穩(wěn)定性等均可通過嵌段共聚物的長度、化學性質(zhì)及功能的改善在較大范圍內(nèi)進行調(diào)整。氧化苦參堿通過抑制HSC增殖，降低膠原表達量和糾正細胞因子異常等發(fā)揮抗纖維化作用。Yang等[17]構(gòu)建了RGD修飾的氧化苦參堿囊泡，該載體平均粒徑95 nm，載藥量為6.8%，表現(xiàn)出慢的釋放速度和持久的釋放時間。該載體靶向性良好，顯著抑制HSC增殖，最大程度緩解模型動物肝纖維化程度。

3 靶向視黃醇結(jié)合蛋白

RBP是極有潛力的靶向結(jié)構(gòu)，它負責VA的攝取與儲存，肝星狀細胞儲存了高達全身80%的VA[18]。VA可以與HSC表面的RBP特異性結(jié)合，因此VA修飾的納米粒具有HSC特異性，通過兩者的結(jié)合可實現(xiàn)藥物靶向HSC遞送。

VA偶聯(lián)的脂質(zhì)體有效改善了纈沙坦的滲透性。口服后熒光追蹤表明該載體表現(xiàn)出極好的肝靶向性且持續(xù)時間長達6 d，HSC免疫熒光染色結(jié)果證明載體在HSC中的靶向以及良好的核吸收[19]。有學者[20]制備了VA偶聯(lián)的伊馬替尼負載脂質(zhì)體?；铙w動物成像結(jié)果顯示該脂質(zhì)體的肝臟積累，并證實其HSC靶向性。靜脈給藥后，修飾的脂質(zhì)體表現(xiàn)出比常規(guī)伊馬替尼高13.5倍的肝臟積累和更少的不良反應，肝功檢查以及肝毒性評估也顯示出羥脯氨酸，TGF-β和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的正?；兔黠@的抗纖維化作用。另一項研究[21]以VA偶聯(lián)的脂質(zhì)體為載體負載肝細胞生長因子基因并將其特異性地遞送至HSC。細胞研究發(fā)現(xiàn)纖維化標志物TGF-β顯著減少，而模型動物中αSMA和膠原沉積減少，表明該載體良好的靶向遞送能力。脂質(zhì)體靶向遞送核酸目前已進入臨床階段，VA修飾的siRNA負載脂質(zhì)體已經(jīng)開始Ⅰ期臨床試驗。在該研究中，VA偶聯(lián)的脂質(zhì)體將siRNA成功遞送至HSC，抑制了膠原的分泌，減輕了纖維化程度[22]。

化學基因療法，即將化學與基因藥物聯(lián)合遞送以達到協(xié)同效應，在肝纖維化治療中仍是尚待開發(fā)的領(lǐng)域。水飛薊賓和小干擾RNA-siCol1α1均可通過抑制Ⅰ型膠原mRNA的表達而用于肝纖維化的治療，兩者的組合遞送可實現(xiàn)更好的肝重塑效果。Qiao等[23]構(gòu)建聚合物膠束并以VA修飾。所得共負載膠束表面帶正電，體外表現(xiàn)出極低的細胞毒性和溶血性，在小鼠體內(nèi)則表現(xiàn)出良好的耐受性。數(shù)據(jù)表明，經(jīng)VA修飾的膠束更有效的積聚在肝臟及活化HSC中，Ⅰ型膠原沉積量減少和肝纖維化的程度減輕更明顯。且與單負載相比，共負載減少Ⅰ型膠原產(chǎn)生改善肝纖維化的效果更明顯。肝纖維化涉及多種信號通路，單一的治療藥物效果有限，而該實驗提供了一種將化學藥物與基因治療相結(jié)合的新思路，利用納米載體將兩者共遞送實現(xiàn)更加理想的治療效果，為肝纖維化治療開辟了新方向。

4 靶向PDGFR

PDGF是由兩條相關(guān)多肽鏈通過二硫鍵連接而成的二聚體。PDGF-B和PDGF-D是刺激HSC增殖和細胞內(nèi)信號傳導的最有效因子[24]。PDGF信號傳導具有調(diào)節(jié)細胞增殖和活化、血管生成、細胞遷移和刺激結(jié)締組織基質(zhì)的主要組分合成的作用。PDGF表達量在急性慢性肝損傷后均增加且PDGF及其受體亞單位表達與纖維化程度高度相關(guān)。

環(huán)肽pPB對PDGFR-β具有特異性識別能力。以pPB修飾空間穩(wěn)定脂質(zhì)體并負載γ-干擾素。體外試驗證明載體能被活化的HSC吸收并完全內(nèi)化，靶向載體的HSC抑制率為非靶向載體和游離藥物的7.24、2.95倍。體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示載體主要積聚在肝臟中定位于活化HSC中，并且具有比游離γ-干擾素更長的半衰期[25]。pPB修飾脂質(zhì)體的包封延長了γ-干擾素的半衰期，并提高其體內(nèi)HSC的靶向效率。

5 結(jié)論與展望

肝纖維化是對幾乎所有形式的慢性肝損傷的常見瘢痕形成反應，特點是HSC的激活和膠原蛋白尤其是Ⅰ型膠原在肝的過度積累。盡管對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機制已經(jīng)有了較好的理解，但臨床尚未有藥物可以有效地治療肝纖維化。一個限制性因素是藥物不能特異性靶向遞送至HSC并且常對實質(zhì)細胞產(chǎn)生毒性作用[26]，需要精準用藥。此外，肝纖維化是一個涉及多種信號通路的復雜疾病，單一的藥物治療抗纖維化作用有限。為了增強治療效果，必須給予患者非常高的劑量，這導致非靶組織或細胞中更多的副作用。藥物聯(lián)合應用和靶向遞送將會是未來肝纖維化治療的研究方向。

納米載體遞送治療肝纖維化在動物模型中表現(xiàn)出廣闊的前景。脂質(zhì)體、膠束等載體在藥物遞送中應用廣泛，對載體進行特異性修飾后達到肝靶向遞送已顯現(xiàn)出巨大的潛力。納米載體的發(fā)展為肝纖維化的預防和治療提供了新的思路和方向。隨著研究的深入，靶向遞送的納米治療也快速更新，并有望成為肝纖維化預防和治療的主要措施。

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（收稿日期：2018-08-30? 本文編輯：蘇? ?暢）