趙君雅 李威 李薇 孫鴻宇 李欣 官杰

[摘要] 目的 探討白介素-17（IL-17）、IL-35在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠腸黏膜中的表達水平及意義。 方法 健康的SD雄性大鼠65只，分為對照組（n = 12）和實驗組（n = 53）。對照組不處理，于實驗組中隨機選取12只SD大鼠進行預(yù)實驗，篩選最合適劑量的2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）造模劑構(gòu)建UC動物模型。大鼠進行正式造模，通過每日觀察體重及一般情況（精神狀態(tài)，糞便形狀、顏色等）的改變，依據(jù)疾病活動度（DAI）評分。剩余大鼠分別于第3、7、14天處死，并結(jié)合潰瘍程度分為A、B、C組，每組各12只（實驗過程中死亡5只）。使用結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）對結(jié)腸評分，判斷潰瘍程度，采用ELISA法檢測腸黏膜中白細胞介素-17（IL-17）、IL-35的含量指標(biāo)，同時評估結(jié)腸病理改變。綜合得出IL-17與IL-35的含量與潰瘍程度的關(guān)系。 結(jié)果 與對照組比較，實驗組DAI、CMDI分?jǐn)?shù)增加，結(jié)腸組織的病理情況鏡下改變顯著（P < 0.05）。各組大鼠腸黏膜組織中IL-17水平隨著潰瘍程度加重明顯升高，IL-35水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展過程中，細胞因子作為炎癥介質(zhì)起到重要作用，IL-17含量與炎性反應(yīng)呈正相關(guān)，可能促進炎性反應(yīng)發(fā)生，而IL-35含量與炎癥程度呈負(fù)相關(guān)，可能抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 潰瘍性結(jié)腸炎;SD大鼠;潰瘍黏膜損傷指數(shù);疾病活動度;白細胞介素-17;白細胞介素-35

[中圖分類號] R574.62? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（c）-0015-04

[Abstract] Objective To investigate the expression level and significance of interleukin-17 （IL-17） and IL-35 in intestinal mucosa of Ulcerative colitis UC rats. Methods Six-five healthy SD male rats were divided into control group （n = 12） and experimental group （n = 53）. The blank control group was not treated， and 12 SD rats were randomly selected from the experimental group for the preliminary experiment， the most appropriate dose of TNBS （2， 4， 6-trinitrobenzenesulfonic acid） modeling agent was selected to build UC animal model. Changes in body weight and general conditions （mental status， stool shape， color， etc.） were observed daily and scored according to disease activity level （DAI） since it has been formally modeled. The rest in the control group were sacrificed on day 3， day 7 and day 14， respectively. The remaining rats were formally modeled and divided into group A ， group B and group C with 12 rats in each group according to the degree of ulcer （5 rats died accidently）. Colonic mucosa damage index （CMDI） was used to score the colon and determine the degree of ulcer. The contents of IL-17 and IL-35 in the intestinal mucosa were detected by ELISA method， and the pathological changes of the colon were evaluated at the same time. The correlation between the levels of IL-17 and IL-35 and the degree of ulcer was obtained. Results Comparison between the experimental group and the blank group， DAI score and CMDI score were increased， and the pathological changes of colon tissue in the experimental group were significant under the microscope （P < 0.05）. The level of IL-17 in the intestinal mucosa of rats in each group increased significantly with the aggravation of the ulcer， and the level of IL-35 decreased significantly， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion During the development of ulcerative colitis， cytokines play an important role as mediators of inflammation. The content of IL-17 is positively correlated with the inflammatory response and may promote the occurrence of inflammatory response， while the content of IL-35 is negatively correlated with the degree of inflammation， and may be involved in inhibiting the occurrence and development of inflammatory response.

[Key words] Ulcerative colitis;SD rats;Colonic mucosa damage;Disease activity level;IL-17;IL-35

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）以慢性非特異性炎癥為主，好發(fā)于結(jié)腸，臨床上多表現(xiàn)為腹部疼痛難忍、稀水樣便甚至癌前病變，病變區(qū)域涉及黏膜表層和黏膜下層。疾病經(jīng)久不愈、反復(fù)發(fā)作，這給患者帶來極大的痛苦。目前關(guān)于UC發(fā)病機制的研究很廣泛，但仍不能明確發(fā)病的原因。國內(nèi)外學(xué)者[1]得出較為統(tǒng)一的觀點，認(rèn)為在遺傳易感宿主暴露在環(huán)境危險因素下（例如細菌感染而引起腸道免疫系統(tǒng)紊亂），異常的免疫反應(yīng)能引發(fā)大量炎癥細胞釋放炎性細胞因子，導(dǎo)致腸道組織受損和影響腸道消化功能。在腸道免疫反應(yīng)應(yīng)答中，細胞因子起到?jīng)Q定性作用。介導(dǎo)UC發(fā)病的細胞因子主要作用可分為促進炎性反應(yīng)及抑制炎性反應(yīng)兩大類，例如腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）等[2]。在調(diào)控腸道免疫反應(yīng)過程中，腸黏膜區(qū)促炎因子含量升高，抑炎因子含量降低，腸黏膜病損區(qū)出現(xiàn)明顯的炎癥表現(xiàn)：局部組織出血、潰瘍，腸道損傷[3]。IL-35是由Treg細胞分泌的新型細胞因子[4]，通過抑制效應(yīng)T細胞的增殖從而抑制炎性反應(yīng)[5]。IL-17是Th17細胞分泌的特征性細胞因子，其能促進炎性反應(yīng)的發(fā)生并協(xié)同其他炎癥介質(zhì)來增強炎性反應(yīng)[6]。本研究通過2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）構(gòu)建UC模型，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IL-17、IL-35在不同潰瘍程度下的含量，以此來探討其在UC發(fā)病過程中的表達及意義，在免疫學(xué)分子水平上進一步認(rèn)識UC的發(fā)病本質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD標(biāo)準(zhǔn)大鼠65只，體重為270～290 g（購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心），SPF級，動物質(zhì)量合格證編號：No.430047000322111，實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2017-0012。飼養(yǎng)于溫度適宜、光照規(guī)律、通風(fēng)良好的環(huán)境下。

1.2 主要試劑和器材

IL-35 ELISA試劑盒（批號：CD-ELA-1580）、IL-17 ELISA試劑盒（批號：CD-ELA-3479）購于武漢純度有限公司;TNBS試劑（批號：SLBT1675）購于Sigma-Aldrich公司;石蠟包埋機（LEICAEG1150H，德國）;切片機（LEICARM2255，德國）;臺式微型離心機（Thermo Electron Corporation，美國）。

1.3 方法

1.3.1 造模? 造模前預(yù)先禁食48 h（正常飲水）。隨機選取65只SD大鼠中12只進行預(yù)實驗。另選取12只作對照組;剩余SD大鼠作為實驗組進行UC造模。對大鼠進行腹腔麻醉，藥品為7%水合氯醛（300 mg/kg）。標(biāo)記灌胃器8 cm處作為止端刻度，并使用其將乙醇-TNBS混合溶液：TNBS液（100 mg/kg）與50%的乙醇0.25 mL從肛門灌入至結(jié)腸部位，以保證造模液精確到達預(yù)定區(qū)域。緩慢注射藥液，之后緩慢旋出灌胃器。造模大鼠采用頭低尾高姿態(tài)倒立10 min后放回籠中，注意保暖，覆蓋衛(wèi)生棉待大鼠自然清醒，仔細記錄其生理變化。自由飲食。實驗組3 d內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、稀水膿血便的模型鼠，作為標(biāo)準(zhǔn)的UC動物模型。

1.3.2 標(biāo)本制備? 實驗過程中有5只大鼠意外死亡。隨機將剩余大鼠分為A、B、C三組，每組各12只，分別在造模后第3、7、14天將其處死。剪取肛門至盲腸末端病損嚴(yán)重的腸管，剝離腸系膜，便于肉眼觀察及進一步病理操作。

1.3.3 觀察指標(biāo)? ①疾病活動度（DAI）變化：參考鄭萍[7]的評分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)數(shù)據(jù)記錄對大鼠進行DAI評分，DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血情況分?jǐn)?shù)）/3。見表1。②結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）[8]是通過肉眼對結(jié)腸大體損傷程度的觀察進行評分。大鼠腸管紋理清晰、黏膜平整、無皺縮、長度正常;腸壁薄厚均勻，未見水腫、破損及潰瘍者記0分;大鼠腸管皺縮，腸壁略有充血，黏膜層次紊亂和/或腫脹，腸道內(nèi)有橘黃色的黏性附著物記1分;腸管皺縮明顯，黑褐色硬皮樣膜狀物附著于充血腫脹的腸道表面，易于撕脫，其下可見潰瘍的腸黏膜并有半成型稀便附著記3分;腸管縮短、僵硬，腸壁淤血情況好轉(zhuǎn)，腸道內(nèi)可見積氣及不成形稀便殘留，黏膜表面有顆粒感，見棕色膜狀物質(zhì)附著于腸道表面，其下可見明顯潰瘍記4分。③以10%的甲醛固定病損嚴(yán)重的結(jié)腸段作為標(biāo)本;經(jīng)石蠟包埋后進行HE染色;應(yīng)用病理學(xué)方法觀察結(jié)腸組織[9]。④ELISA法檢測UC大鼠腸黏膜組織中的IL-17、IL-35水平。比較各組大鼠DAI、CMDI評分，以及UC大鼠腸黏膜組織中IL-17、IL-35水平含量的差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所測數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAI評分

密切觀察大鼠造模后生理狀態(tài)，根據(jù)疾病活動度評分標(biāo)準(zhǔn)進行記錄，對照組大鼠反映靈敏，表現(xiàn)活躍，毛色光滑，進食、排便正常。按潰瘍程度分為A組、B組、C組：A組DAI評分為輕度，對刺激表現(xiàn)不活躍，糞便不成形;B組DAI評分為重度，不活躍，毛色暗淡，身體顫抖，糞便可見肉眼黑褐色血便;C組DAI評分為中度，精神萎靡，進食顯著減輕，但腹瀉較重度組有所緩解，大鼠表現(xiàn)有所恢復(fù)。DAI分值越高，說明UC越嚴(yán)重，A組至B組大鼠癥狀逐漸嚴(yán)重，C組有好轉(zhuǎn)趨勢。

2.2 CMDI評分

對照組大鼠腸道無縮短，腸壁黏膜平整，紋路自然，未見腫脹、糜爛及潰瘍;A組大鼠的腸管發(fā)生皺縮，有不成形稀便殘留，腸壁嚴(yán)重充血，黏膜紊亂，可見腫脹，有橘黃色的黏性物質(zhì)附著于腸道內(nèi);B組大鼠腸管縮短、僵硬，但壁內(nèi)淤血略有好轉(zhuǎn)，顆粒狀腸黏膜表面有棕色膜狀物質(zhì)附著，其下可見明顯潰瘍;C組大鼠腸管皺縮明顯，黑褐色膜狀物附著于嚴(yán)重充血的腸壁表面，其下可見明顯的腸黏膜糜爛。CMDI評分為：對照組1分;A組 1.5分;B組 4分;C組 3分。隨造模時間變化，CMDI評分呈現(xiàn)先顯著升高后降低，提示A組至B組結(jié)腸損傷程度逐漸加重，C組損傷程度緩解。

2.3 病理分析

鏡下可見對照組大鼠腸黏膜僅有少量淋巴細胞浸潤，上皮完整，各層結(jié)構(gòu)清晰明了，杯狀細胞密集，無糜爛及潰瘍等病損表現(xiàn);A組鏡下可見黏膜下層大量中性粒細胞浸潤，腸黏膜的基本結(jié)構(gòu)消失，杯狀細胞減少，肌層變厚，隱窩結(jié)構(gòu)加深，層次混亂，腸壁水腫，可見出血灶。B組鏡下可見大量深達黏膜下層、肌層甚至漿膜層的以淋巴細胞及中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤;腺上皮細胞排列紊亂，部分可見輕度增生及炎性肉芽腫。C組鏡下可見黏膜下肉芽組織形成，炎性細胞大量浸潤及纖維組織大量增生，部分潰瘍開始愈合。可以見得，A、B、C三組大鼠炎癥的變化由初期逐漸加重至后期趨于緩解。

2.4 各組腸黏膜IL-17、IL-35的含量比較

經(jīng)單因素方差分析，對照組、A組、B組、C組之間的IL-17、IL-35兩個指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。隨大鼠病情由逐漸加重直至趨于恢復(fù)的過程中，A、B、C三組中的IL-17含量先升高后輕微下降、IL-35含量先下降隨后略為升高的趨勢。經(jīng)LSD檢驗進一步兩兩比較，對照組與A、B、C三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。A組與B、C兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），B、C兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。通過比較各實驗組UC模型由輕到重至逐漸恢復(fù)的過程，可發(fā)現(xiàn)雖然C組大鼠腸黏膜中的IL-17含量高于A組（P < 0.05），但存在著先逐漸升高后輕微下降的變化趨勢;而C組IL-35含量低于A組（P < 0.05），存在著先逐漸降低再略微升高的變化。

3 討論

炎癥性腸病發(fā)病以歐美國家患病率最高[10]，具有明顯的地域性差異。UC的發(fā)病率為9/10萬～12/10萬，患病率為205/10萬～240/10萬[11-13]?，F(xiàn)有研究[14-15]表明，自身免疫反應(yīng)為該病的重要發(fā)病機制，IL-17和IL-35與UC的發(fā)病關(guān)系密切。

本實驗通過CMDI、DAI進行疾病評分。與對照組比較實驗組大鼠存在著不同程度的黏液膿血便、體重下降等癥狀，結(jié)腸損傷程度大小不一;通過比較實驗組大鼠間的病情變化發(fā)現(xiàn)：第3天至第7天逐漸嚴(yán)重，約至第14天病情開始出現(xiàn)恢復(fù)跡象。

目前多數(shù)學(xué)者[16]的觀點認(rèn)為，IL-17主要是由Th17細胞產(chǎn)生。Ulhig等[17]發(fā)現(xiàn)在重組激活基因（RAG）缺失的情況下，IL-23仍可誘導(dǎo)IL-17的表達;由于RAG大鼠中缺乏T細胞和B細胞，說明IL-23可能并不是T細胞產(chǎn)生的，而可能是通過誘導(dǎo)先天免疫細胞產(chǎn)生IL-17，這為IL-17參與先天免疫產(chǎn)生提供了證據(jù)。近年來，動物模型實驗的多種研究工作揭示了IL-17和IL-23在炎癥性腸病中的作用[18]，IL-17可能促進了UC的慢性炎癥的形成過程，IL-17表達水平與UC有密切相關(guān)性。依據(jù)本實驗結(jié)果，在實驗組大鼠UC由輕度逐漸加重至好轉(zhuǎn)的過程中，腸黏膜的IL-17水平由A組至B組顯示升高（P < 0.05），而B組至C組IL-17呈現(xiàn)少量減少，由于第14天可能為疾病好轉(zhuǎn)初期[19]，所以IL-17水平與疾病程度對應(yīng)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），IL-17同病情表現(xiàn)呈正相關(guān)性。本實驗與鄭紫丹等[20]的研究成果類似，進一步證明了IL-17能促進UC的發(fā)生和發(fā)展。

IL-35作為一種具有強大抗炎作用的新型細胞因子，具有強大的抗炎作用[21]。IL-35可以誘導(dǎo)T細胞分化為一種具有免疫抑制介導(dǎo)作用的新型調(diào)節(jié)性T細胞（iTr35）[22]，對腸道免疫應(yīng)答具有重要的保護作用。依據(jù)唐文靜等[23]研究，隨著UC病情的加重，患者血清IL-35濃度隨之減少。本研究中，在UC逐漸加重至出現(xiàn)好轉(zhuǎn)的過程中，實驗組腸黏膜的IL-35水平從A組至B組降低（P < 0.05），B組和C組少量升高。第14天可能為疾病好轉(zhuǎn)初期，但IL-35升高差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），IL-35水平同病情表現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)論與唐文靜等[23]的結(jié)果類似，從而進一步證明了IL-35的減少，可能抑制了炎癥的發(fā)展。

綜上所述，本實驗進一步證明了隨著UC病情逐漸嚴(yán)重，在病損區(qū)IL-35水平逐漸升高，IL-17水平逐漸降低。通過免疫學(xué)檢測方法，發(fā)現(xiàn)UC與炎性反應(yīng)密切相關(guān);通過細胞因子的定量檢測，為炎癥發(fā)展提供了確鑿的證據(jù)，這對判斷UC病情嚴(yán)重程度，提供了新的檢測指標(biāo)，同時可以在免疫學(xué)分子水平上進一步認(rèn)識UC的發(fā)病本質(zhì)。這為今后進一步探索UC治愈方法提供了理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1]? Ohkusa T，Koido S. Intestinal microbiota and ulcerative colitis [J]. J Infec Chemother，2015，21（11）：761-768.

[2]? 魏永凱，李輝，李貴軻，等.潰瘍性結(jié)腸炎炎癥介質(zhì)與免疫應(yīng)答的研究[J].廣州化工，2016，44（9）：10-12，18.

[3]? Sventoraityte J，Zvirbliene A，Kiudelis G，et al. Immune system alterations inpatients with inflammatory bowel disease during remission [J]. Medicina（Kaunas），2008，44（1）：27-33.

[4]? 修晶輝.白細胞介素35（IL-35）轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及過表達IL-35改善小鼠哮喘癥狀的機制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2014.

[5]? 董月皎.IL-35負(fù)向調(diào)控慢性乙型肝炎患者效應(yīng)性T細胞的作用及其相關(guān)機制研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2017.

[6]? 廖競.Th17細胞與兒童中性粒細胞性哮喘氣道炎癥相關(guān)性研究[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[7]? 鄭萍，牛鳳麗，彭延申，等.氧化苦參堿對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎影響的初步研究[J].胃腸病學(xué)，2001（4）：209-210，222.

[8]? Shah TA，Parikh M，Patel KV，et al. Evaluation of the effect of Punica granatum juice and punicalagin on NFκB modulation in inflammatory boweldisease [J]. Mol Cell Bioc-hem，2016，419（1/2）.

[9]? 趙平，董蕾，羅金燕，等.DSS與TNBS誘導(dǎo)大鼠實驗性結(jié)腸炎模型的對比研究[J].胃腸學(xué)，2015，20（11）：667-677.

[10]? Hanauer SB. Inflammatory bowel disease：Epidemiology，pathogenesis，and therapeutic opportunities [J]. Inflamm Bowel Dis，2006，12（Suppl 1）：S3-S9.

[11]? Kappelman MD，Rifas-Shiman SL，Kleinman K，et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn′s disease and ulcerative colitis in the United States [J]. Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5（12）：1424-14299.

[12]? Herrington LJ，Liu L，Lewis JD，et al. Incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in a Northern California managed care organization，1996-2002 [J]. Am J Gastroenterol，2008，103（8）：1998-2006.

[13]? Loftus CG，Lofus EV，Harmsen WS，et al. Update on the incidence and prevalence of Crohn′s disease and ulcerative colitis in Olmsted County，Minnesota，1940-2000 [J]. Inflamm Bowel Dis，2007，13（3）：254-261.

[14]? 林巧嫦，廖博賢，黃飛娜.白細胞介素IL-4，IL-17在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達[J].中國醫(yī)藥學(xué)，2012，2（16）：44-45.

[15]? 張欣，李洺，楊嫣華，等.炎癥性腸病患者血清TNF-α，IL-35水平變化及其臨床意義[J].內(nèi)科急危重癥雜志，2017，23（5）：400-402.

[16]? Weaver CT，Harringt on LE，Mangan PR，et al. Thl7：an effector CD4+T cell lineage with regulatory T cell ties [J]. Immunity，2006，24（6）：677-688.

[17]? Uhlig HH，Mckenzie BS，Hue S，et al. Differential activity of IL-12 and IL-23 in mucosal and systemic innate immune pathology [J]. Immunity，2006;25（2）：309-318.

[18]? 施沛青，朱書，錢友存.IL-17的信傳導(dǎo)及功能研究[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2011，33（4）：345-357.

[19]? Simon H，F(xiàn)ischer T，Almasi A，et al. Effects of mesalazine on morphological and functional changes in the indomethacininduced inflammatory bowel disease （Rat Model of Crohn′s Disease） [J]. Pathology Oncology Research Por，2016，7（2）：1-6.

[20]? 鄭紫丹，萬曉強，劉梁英.潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IL-23和IL-17的水平變化及意義[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（2）：203-204.

[21]? Collison LW，Chaturvedi V，Henderson AL，et al. IL-35-mediated induction of a potent regulatory T cell population [J]. Nat Immunol，2010，11（12）：1093-1101

[22]? 季明昉，孟曉弘，方一，等.炎癥性腸病患者外周血白細胞介素12家族細胞因子的表達及臨床意義[J].診斷學(xué)理論與實踐，2015，14（2）：131-135.

[23]? 唐文靜，王婷婷，汪良芝.IL-35在炎癥性腸病中的表達及臨床價值[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2016，11（2）：142-144.

（收稿日期：2018-08-30? 本文編輯：封? ?華）