劉麗娟 陳金之 張志軍 姜梅杰,*

(1 萊蕪市人民醫(yī)院檢驗科，萊蕪 271100；2 泰安市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，泰安 271000；3 泰安市中心醫(yī)院檢驗科，泰安 271000)

鮑曼不動桿菌已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。2012—2016年非發(fā)酵糖革蘭陰性菌中，鮑曼不動桿菌分離率一直位居第一位[1-5]。Ying等[6]報道華南7個地區(qū)146株多重耐藥鮑曼不動桿菌，主要是ST208，其次是ST191和ST729。Li等[7]報道17株MDRAB和35株XDRAB中，ST195可能是中國廣州最常見的ST。Ning等[8]報道2009年6月—2014年11月中國北京101株MDRAB中，主要是ST191和ST195。因此不同地區(qū)、甚至不同醫(yī)院分離MDRAB主要流行的序列類型及耐藥性基因也不完全相同。為探明MDRAB在醫(yī)院內(nèi)傳播的原因，預防MDRAB在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生克隆株流行，我們對該院4年間MDRAB分子流行病學特征進行了研究。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2013—2016年間萊蕪市人民醫(yī)院住院患者標本中分離出的51株MDRAB，其中34株來自重癥監(jiān)護病房(ICU)的患者，10株來自神經(jīng)外科病房的患者，7株來自神經(jīng)內(nèi)科病房的患者。50株標本來源于痰液，1株來源于尿液。

1.2 細菌鑒定及藥敏試驗

采用BD鳳凰phoenixTM100 NMIC/ID-4復合板鑒定菌種及藥敏試驗，同時用K-B紙片擴散法檢測頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素的敏感性，藥敏試驗執(zhí)行最新版的美國臨床實驗室標準化研究協(xié)會(CLSI)標準。其中替加環(huán)素敏感性試驗執(zhí)行FDA的標準，頭孢哌酮/舒巴坦敏感性試驗執(zhí)行CLSI中頭孢哌酮的標準。MH瓊脂和藥敏紙片均為英國Oxoid產(chǎn)品。MDRAB的判斷標準是根據(jù)Magiorakos等[9]報道的標準進行判斷。銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218作為質(zhì)控菌株。

1.3 耐藥基因檢測

采用煮沸法提取細菌DNA模板，碳青霉烯酶類相關耐藥基因采用多聚酶鏈反應(PCR)方法。PCR反應體積為50μL，含H2O 31.75μL，10×PCR緩沖液5μL，dNTPs MIX(10mmol/L) 4μL，正反向引物各2μL，1.25UTap酶，10～100ng DNA模板5μL。PCR擴增儀使用MJ-PTC-100(BIO-RAD)。退火溫度參照文獻[10]。碳青霉烯酶類相關耐藥基因引物參照文獻文獻[10]，blaNDM-1基因PCR擴增引物序列參照中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所公布的引物序列。

1.4 多位點序列(MLST)基因分型

參照Bartual等[11]方法進行檢測分析。對鮑曼不動桿菌的7個管家基因進行序列擴增并測序，將測序結(jié)果在鮑曼不動桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/abauniannii/)中進行BLAST比對分析，得到每個管家基因?qū)牡任换蚓幪枴Ｈ缓髮ltA-gyrB-gdhBrecA-cpn60-gpi-rpoD這一組管家基因編號的組合稱為管家基因譜，每一個編號的組合對應一個序列型(sequence type,ST)。與MLST數(shù)據(jù)庫中已有管家基因譜進行比對，得到每株細菌對應的ST型。

1.5 DNA測序

隨機取不同MLST的陽性基因進行測序，PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進行測序(ABI3730XL全自動DNA測序儀)，測序結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢。

1.6 統(tǒng)計分析

用WHONET5.6軟件對臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌進行篩選,所有篩選出的菌株數(shù)據(jù)用WHONET5.6軟件進行耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果

51株MDRAB對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、復方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥率為100%(51/51)；對美羅培南和亞胺培南的耐藥率為94.1%(48/51)；對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別為84.3%(43/51)和90.2%(46/51)；對頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素的耐藥率分別為62.7%(32/51)和23.5%(12/51)；對多黏菌素B 100%敏感。

2.2 碳青霉烯酶相關耐藥基因檢測及測序結(jié)果

51株MDRAB中，blaOXA51基因都陽性(圖1)，48株(94.12%)blaOXA23組基因陽性(圖2)。隨機取不同MLSTblaOXA51陽性基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果均為blaOXA51型碳青霉烯酶基因(圖3)。隨機取不同MLSTblaOXA23組陽性基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果均為OXA23型碳青霉烯酶基因(圖4)。未檢出blaIMP、blaKPC、blaNDM-1、blaOXA-24、blaOXA-48、blaOXA-50、blaOXA-55、blaOXA-58和blaOXA-60碳青霉烯酶基因。

2.3 MLST分子分型結(jié)果

將51株MDRAB進行MLST分子分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3種STs，依次為ST191(52.94%)、ST208(31.37%)和ST136(15.69%)，均屬于克隆復合體CC92。本文收集的樣本中，序列型ST191和ST208是主要的序列類型，其次是ST136。4年間ST208在醫(yī)院內(nèi)持續(xù)性的播散，ST191和 ST136在不同時間段間斷性的播散在該醫(yī)院4年間51株MDRAB 3種STs分型結(jié)果及碳青霉烯酶陽性基因的分布情況見表1。

3 討論

鮑曼不動桿菌是院內(nèi)常見的非發(fā)酵革蘭陰性菌之一。已有報道多重耐藥鮑曼不動桿菌主要引起下呼吸道感染[12]，主要分布在重癥監(jiān)護病房[13-14]。該院2013—2016年間臨床分離的51株MDRAB中，50株標本來源于患者的痰液，34株標本來源于重癥監(jiān)護病房(ICU)，說明MDRAB主要引起呼吸道感染并且分布在ICU患者。

圖1 blaOXA51基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 blaOXA51 genes PCR results electropherogram

圖2 blaOXA23基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 blaOXA23 genes PCR results electropherogram

圖3 blaOXA51基因測序圖Fig.3 blaOXA51 genes sequencing diagram

圖4 blaOXA51基因測序圖Fig.4 blaOXA23 genes sequencing diagram

已有報道鮑曼不動桿菌攜帶blaOXA-23型碳青霉烯酶與碳青霉烯類耐藥相關[15-17]。本研究51株MDRAB均攜帶blaOXA-51型碳青霉烯酶基因，48株攜帶blaOXA-23型碳青霉烯酶基因的MDRAB對亞胺培南和美羅培南都耐藥，3株未檢出blaOXA-23型碳青霉烯酶基因的MDRAB對亞胺培南和美羅培南都敏感，對頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢塞肟、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦都耐藥，說明blaOXA-23型碳青霉烯酶與亞胺培南和美羅培南耐藥密切相關，這與有關報道相一致[15-17]。

不同地區(qū)院內(nèi)分離的MDRAB主要流行的序列類型及耐藥性基因也不完全相同[6-8]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，在收集的樣本中，序列類型ST191(52.94%)和T208(31.37%)是主要的序列類型，其次是ST136(15.69%)，均屬于全球流行的CC92克隆群，其祖先ST型為ST92，與國內(nèi)外的研究類似[18-19]。雖然CC92克隆復合體在全球流行，但不同地區(qū)的流行株仍各有其特點，這可能不同地區(qū)的抗生素使用習慣等環(huán)境選擇壓力影響ST92的遺傳方向而造成的后果。表1顯示，該院4年間ST208型產(chǎn)blaOXA-23型酶基因的MDRAB在院內(nèi)持續(xù)性的播散，ST191型MDRAB在2013年、2014年和2015年檢出，但在2016年篩選出的12株MDRAB中未檢出ST191型MDRAB，說明該院ST191型MDRAB在院內(nèi)可能存在間斷性的播散。我們的研究僅在2016年篩選出的12株MDRAB中檢出了ST136型產(chǎn)blaOXA-23型酶基因的MDRAB，在2016年未檢出ST191型MDRAB，說明該院MDRAB流行菌株可能有變化。本研究發(fā)現(xiàn)該院發(fā)生過克隆株的流行。因此醫(yī)院感染控制部門要進一步關注醫(yī)院內(nèi)耐藥菌的傳播，這對醫(yī)院感染控制是非常有幫助的。

表1 51株MDRAB STs分布及碳青霉烯酶陽性基因分布情況Tab.1 Distribution of fifty-one MDRAB STs strains and carbapenem positive gene

本研究51株MDRAB中，有3株對亞胺培南和美羅培南敏感(這3株是ST191型未檢出blaOXA-23型酶基因的MDRAB)，其余48株耐藥。1株對頭孢哌酮/舒巴坦敏感、18株中介、32株耐藥，27株對米諾環(huán)素敏感、12株中介、12株耐藥，對多黏菌素B都敏感，對頭孢他啶等10種抗菌藥物都耐藥。因此臨床醫(yī)師治療MDRAB引起的感染必須根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗菌藥物。

綜上所述，該院臨床4年間分離的MDRAB存在克隆株的流行，醫(yī)院應進一步加強消毒隔離措施，防止院內(nèi)多重耐藥鮑曼不動桿菌的暴發(fā)流行。