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1.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000

肝纖維化是由于各種原因導致的慢性肝損傷過程，可使以膠原蛋白為主的細胞外基質(Extracellular matrixc, ECM)在肝臟中大量沉積。肝纖維化如果沒有及時有效的治療，可進一步發(fā)展為肝硬化，并誘發(fā)肝細胞功能障礙及門靜脈高壓等一系列并發(fā)癥，嚴重則可能導致肝癌的發(fā)生[1]。但是肝纖維化是可逆的，及時阻止或逆轉肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，是防治肝硬化和慢性肝病，提高肝病患者的生命質量和生存率的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細胞(Hepatic stellate cells, HSC)的活化增殖是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，HSC被激活后可轉化為肌成纖維細胞，并誘導促纖維化細胞因子的分泌，增加膠原的合成，從而導致肝纖維化的發(fā)生[2-5]。Ca2+對細胞生理活動起到極其重要的調節(jié)作用，細胞內Ca2+濃度的增加是細胞增殖分裂的必要條件[6-7]。在HSC活化過程中，細胞內Ca2+是諸多生長因子、氧化應激產(chǎn)物及細胞因子等發(fā)揮促生長和增殖作用的主要介質之一，因此通過測定HSC內Ca2+濃度可以間接了解其生長情況。

近年來許多藥物如秋水仙堿、還原型谷胱甘肽、水飛薊賓等都被用于肝纖維化的治療，但臨床效果卻不理想[8]。水飛薊賓(Silybin, SF)是水飛薊素中含量最高、活性最強的成分，因其具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等藥理作用，臨床廣泛用于各種肝膽疾病的治療[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物具有促進組織修復、消炎止痛、抗肝纖維化和抗腫瘤,增強免疫活性等藥理作用[11-12]。肝龍膠囊(Ganlong capsule, GL)是從美洲大蠊中提取的以粘糖氨酸和復合核苷類為主要成分的抗肝炎新藥[13]，具有療效確切不良反應少等優(yōu)點，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于臨床實踐。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，單用水飛薊賓對HSC的抑制作用不如水飛薊賓聯(lián)合肝龍。含藥血清經(jīng)過了機體代謝可以更好的模擬藥物的最終有效成分，更接近藥物在體內的藥理效應，從而可以更準確的研究其藥理機制。本研究選用大鼠HSC，分別給予水飛薊賓單用及水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清處理，觀察其對HSC增殖活性的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料 SD雄性健康成年大鼠，體重(180±20) g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2011-0003；大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)購自中科院昆明細胞庫(編號:KCB200703YJ)。

1.1.2 藥物與試劑 水飛薊賓膠囊(批號：16041601，天津天士力圣特制藥有限公司)；肝龍膠囊(批號：550706087，昆明賽諾制藥有限公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；噻唑藍(MTT)、Hepes(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；碳酸氫鈉(天津市風船化學試劑科技有限公司)；Fluo-3/AM(美國Millipore公司)。

1.2 儀器與設備 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)；CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus)；離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)貿易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清的制備 SD雄性大鼠隨機分為肝龍組(150 mg/kg)，水飛薊賓組(28 mg/kg)及空白對照組(0.9% NaCl溶液),按1 mL/100g給藥容量，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃7 d，最后一次灌胃前禁食不禁水12 h，末次灌胃給藥1 h后，用異氟烷麻醉腹主動脈取血，采用一次性非抗凝真空采血管收集全血，靜置4 h，3000 r/min離心10 min,分離血清，經(jīng)56 ℃恒溫滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HSC-T6細胞培養(yǎng)及藥物分組 從-80 ℃超低溫冰箱取出HSC-T6細胞，用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素抗生素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)，待細胞融合率達80%～90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，實驗時選取對數(shù)期生長良好的細胞。根據(jù)水飛薊賓含藥血清(7.5%、15%、30%)及肝龍膠囊含藥血清(7.5%、15%、30%)進行2因素3水平完全實驗設計，同時設空白血清對照組，水飛薊賓及肝龍膠囊含藥血清濃度編號見表1。

表1 水飛薊賓及肝龍膠囊含藥血清濃度編號

1.3.3 MTT法檢測水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC增殖的影響 用0.25%的胰酶將處于對數(shù)生長期的HSC-T6細胞消化后，用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，使細胞密度為6×104個/mL接種于96孔板，細胞懸液終體積為100 μL，置于37 ℃、5% CO2條件下進行無菌培養(yǎng)24 h，待細胞生長旺盛貼壁后更換不同濃度含藥血清的培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基，每組設3個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。棄去舊培養(yǎng)基用PBS小心清洗2遍，將20 μL濃度為5 mg/mL的MTT依次加入各孔，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，之后每孔分別加入150 μL的DMSO，充分振蕩，使甲臜充分溶解，用多功能酶標儀在490 nm波長處檢測其吸光度值(A490)。

細胞存活率=(OD藥物組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)；

細>胞>抑>制>率>=1-(OD藥物組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)。

1.3.4 激光掃描共聚顯微鏡檢測細胞內游離Ca2+的濃度 根據(jù)水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC增殖作用的影響發(fā)現(xiàn)，30%水飛薊賓聯(lián)合不同濃度肝龍含藥血清對HSC的抑制作用較好，故本次研究用激光掃描共聚顯微鏡檢測其對細胞內游離Ca2+濃度的影響。將培養(yǎng)的細胞取出，棄去含胎牛血清培養(yǎng)基，用HBSS溶液洗滌細胞至少3次；在每孔細胞中加入30 μL Fluo 3-AM工作液；37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內孵育30 min，之后除去工作液,為充分洗去工作液，加入HBSS溶液清洗細胞3次，然后每孔加入20 μLHBSS溶液覆蓋細胞；37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內孵育約25 min后，用激光共聚焦顯微鏡來檢測細胞內Ca2+的濃度。設置掃描條件：20×倍鏡下、激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm，10%激光強度、PMT(1100)。計算整個細胞的平均熒光強度，記錄熒光強度的相對值(%)以觀察Ca2+濃度動態(tài)變化。計算公式：Ca2+濃度=Kd( F-Fmin)/( Fmax-F)。(F：實時熒光強度；Fmax：0.1%TritonX-100 測得的熒光強度值；Fmin：5 mM EGTA 測得的熒光強度值；Kd =400 nmol/L)[14]。

2 結果

2.1 水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC增殖的作用 不同濃度水飛薊賓單用及聯(lián)合不同濃度肝龍含藥血清分別作用HSC24、48和72 h，單用7.5%和15%水飛薊賓含藥血清組對HSC的增殖作用不明顯(P>0.05)，單用30%水飛薊賓含藥血清處理24 h時，其抑制率為16.5%；水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清組對HSC抑制作用顯著高于單用水飛薊賓含藥血清組(P<0.01)。見表2。

表2 水飛薊賓單用及合用肝龍含藥血清對HSC增殖的影響

注：與單用水飛薊賓含藥血清組相比，▲P<0.01。

2.2 30%水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC內Ca2+濃度的影響 在單獨用藥情況下：與空白血清組相比，水飛薊賓組HSC內Ca2+濃度在24、48、72 h分別降低27.80%、67.06%、50.70%；聯(lián)合用藥時：與單用水飛薊賓含藥血清組相比，水飛薊賓+7.5%肝龍組HSC內Ca2+濃度在24 h時一過性增加，隨著作用時間的延長，在48 h時HSC內Ca2+濃度降低26.49%，在72 h 時HSC內Ca2+濃度增加29.34%；水飛薊賓+15%肝龍組HSC內Ca2+濃度在24、48、72 h分別降低13.46%、29.34%、36.49%；水飛薊賓+30%肝龍組HSC內Ca2+濃度在24、48 h分別增加0.78%、26.77%，在72 h降低15.97%。如圖1所示。

3 討論

近年來我國肝硬化、肝癌的患病率居高不下，肝纖維化作為這兩大疾病的必經(jīng)階段,是一個可逆的過程。本研究以大鼠為實驗對象，研究水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清在體外對HSC增殖活性的影響，結果表明水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC的抑制作用強于單用水飛薊賓,隨著對肝纖維化機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，正常肝細胞經(jīng)酒精、病毒、藥物等作用損傷，產(chǎn)生炎癥，刺激并激活HSC，激活的HSC轉化為肌成纖維細胞，進一步誘發(fā)促纖維化細胞因子分泌和增加膠原的合成，使細胞外基質過量產(chǎn)生，引起肝纖維化[2-3]。HSC在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的增殖能力明顯增強。因此認為可以通過抑制HSC的活化和增殖來逆轉肝纖維化。

通過激光共聚焦測定HSC內Ca2+濃度發(fā)現(xiàn)，與單用水飛薊賓相比，肝龍聯(lián)合水飛薊賓含藥血清在一定程度上可使細胞內游離Ca2+濃度明顯降低，其中水飛薊賓聯(lián)合15%肝龍含藥血清時，HSC內游離Ca2+濃度降低最為明顯。細胞內Ca2+濃度與HSC生長和增殖作用密切相關，它能參與諸多細胞因子、生長因子及氧化應激產(chǎn)物等對HSC的調控。這些因子通過增加細胞膜鈣通道活性，促進Ca2+內流，使細胞內Ca2+濃度增加，引起HSC的收縮和有絲分裂[7]。并且，已有研究表明[15]大鼠HSC內Ca2+濃度增加會引起HSC收縮。值得注意的是，與單用水飛薊賓組相比，水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清作用HSC 24、48 h，在肝龍含藥血清濃度為15%時可降低HSC內游離Ca2+濃度，而在肝龍含藥血清濃度為30%時可增加HSC內游離Ca2+濃度，在一定程度上表現(xiàn)出肝龍對HSC內游離Ca2+具有雙向調節(jié)作用。推測肝龍對Ca2+的抑制與促進作用可能與藥物濃度、作用時間和藥物的體內代謝有關，而對不同疾病還需要考慮病情來選擇最佳給藥劑量，但這還有待進一步研究。

綜上所述，肝龍能夠增強水飛薊賓含藥血清對HSC的抑制作用，從而達到增強在體外的抗肝纖維化的作用，其作用機制可能與調控細胞內Ca2+濃度有關。但本次實驗尚存在許多不足，本研究所用的細胞為大鼠肝星狀細胞，與人源細胞存在一定的種屬差異，因此下一步可以選用人源細胞作為實驗對象來加以證實，同時對肝龍的體內藥物代謝動力學進行研究，為臨床水飛薊賓和肝龍膠囊的聯(lián)合應用提供更充分的依據(jù)。