魏蔚 楊淑改

（1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 河南 新鄉(xiāng) 453000）

（2 平頂山學(xué)院 河南 平頂山 467000）

隨轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)惡性腫瘤基因組DNA表現(xiàn)為缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，從而導(dǎo)致加工轉(zhuǎn)錄過程更明確。長鏈非編碼RNA是最近發(fā)現(xiàn)的一類主要類型的非編碼RNA，其長度超過200個(gè)核苷酸[1]。近年來，不斷有新出現(xiàn)的證據(jù)表明，一些lncRNA如PVT1在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。通過表觀遺傳調(diào)控的生物學(xué)功能，包括甲基化，乙?；头核鼗认嚓P(guān)作用[2]。

PVT1位于12q14.1上的基因位點(diǎn)，長度為1567nt，已被發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤中存在過表達(dá)情況。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，PVT1的表達(dá)增加通過與表觀遺傳蛋白相互作用調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）被定義為致癌蛋白，可以一定程度上促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，使其成為惡性腫瘤的預(yù)后和治療靶點(diǎn)。此前，證明TGF-β在肝細(xì)胞癌中通過H3K27修飾進(jìn)行表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)[4]。然而，PVT1在結(jié)腸癌中與TGF-β的相互作用不甚清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過假設(shè)lncRNA PVT1通過TGF-β通路蛋白表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，首先明確PVT1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平。通過進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測定，進(jìn)一步研究了PVT1在結(jié)腸癌的生物學(xué)功能相關(guān)性

1.材料和方法

1.1 細(xì)胞株及相關(guān)材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29，SW 480，SW620及RKO購買于上海中科院，RPMI-1640培養(yǎng)基和胰酶購買于美國Gibco公司；胎牛血清和雙抗購買于美國?？寺」荆籔BS磷酸鹽緩沖液購買于美國Gibco公司。

1.2 組織樣品

結(jié)腸癌組織收集2018年1月—8月經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌組織50例。腫瘤組織離體后，去除血跡，放入4%多聚甲醛中固定。

1.3 miRNA提取和qPCR試驗(yàn)

使用來自TRIzol試劑按照制造商的說明分離來自組織或細(xì)胞系的miRNA。根據(jù)制造商的說明，分別使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PrimeScirpt RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）。U6內(nèi)參用作標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。通過2-△△Ct法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本研究中使用的引物如下：PVT1序列F：5'-AGGCTGGGATGGCGAGGGGCA-3'，R：5'-TTGAGCGGCGAGGGAGGGCTAG-3';U6：5'-TAGGCGGATGCGGGCGGATC-3'，R：5'-GATCTATTTCGAGCGATGGA-3'。

1.4 MTT增殖實(shí)驗(yàn)

通過比色MTT增殖能力測定。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的結(jié)腸癌細(xì)胞以初始密度為2×104細(xì)胞/孔接種到96孔板中。24小時(shí)后，48小時(shí)及72小時(shí)后，然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150μl二甲基亞砜，在室溫下攪拌10min保證晶體充分溶解。然后在96h進(jìn)行MTT測定波長為490nm時(shí)的吸光度，計(jì)算結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell侵襲試驗(yàn)

使用孔徑為8μm的Transwell室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲檢測。 用si-PVT1或NC轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，將無血清DMEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞懸浮液（5×104細(xì)胞）置于上室中，其預(yù)先涂有Matrigel（用于侵襲測定）。將包含10%FBS的培養(yǎng)基加入下室作為化學(xué)引誘物。將細(xì)胞在37℃下孵育24小時(shí)，然后用棉簽除去上室上的剩余細(xì)胞。下室表面上的入侵或遷移的細(xì)胞用100%甲醇固定，用0.5%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下，從每個(gè)室中隨機(jī)選擇的5個(gè)視野中觀察并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡

在干預(yù)處理后收獲接種在6孔板中的細(xì)胞，并使用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商的方案進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。通過使用BCA試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。將每個(gè)樣品的40±20μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的Tris基生理鹽水-吐溫20（TBST）室溫封閉膜1小時(shí)。TGF-β（1∶1000）、Smad2（1∶1000）和α-SMA（1∶1000）和GAPDH（1∶2000）與膜在4℃溫育過夜。用TBST洗滌三次后，將二抗（1∶2000）針對(duì)相關(guān)的一級(jí)抗體在室溫下與膜孵育2小時(shí)。使用電化學(xué)發(fā)光（ECL）使蛋白顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用軟件DPS v9.50進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)。P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 PVT1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況。

qPCR結(jié)果表明：（圖1A）與矮胖正常組織相比，結(jié)腸癌組織中PVT1 mRNA表達(dá)水平較高[（1.28±0.18）vs （2.78±0.12），P＜0.05]；與其他細(xì)胞株相比（圖1B），HCT8和SW620細(xì)胞中PVT1 mRNA表達(dá)水平較高[（3.58±0.18）vs（3.05±0.28），P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PVT1在HCT8和SW620細(xì)胞株中表達(dá)水平比其他結(jié)腸癌細(xì)胞株較高，考慮PVT1在結(jié)腸癌中可能扮演起促癌作用。

圖1 （A）結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中PVT1的表達(dá)水平。（B）不同類型結(jié)腸癌細(xì)胞株中PVT1的表達(dá)水平。*P＜0.05。

2.2 PVT1與結(jié)腸癌患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)把50例結(jié)腸癌腫瘤組織樣本和癌旁正常組織進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在不同性別和年齡段的結(jié)腸癌患者之間PVT1的表達(dá)水平差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05；表1）。隨著結(jié)腸癌分期越高，結(jié)腸癌患者組織中的PVT1的表達(dá)水平越明顯，存在結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組織中PVT1的表達(dá)越明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；表1）。

表1 結(jié)腸癌患者組織中PVT1的表達(dá)與其臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 PVT1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

圖1A示，慢病毒轉(zhuǎn)染HCT8和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞株后，PVT1的表達(dá)水平相對(duì)降低。MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2B，C），PVT1-siRNA實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖速率低于Vector對(duì)照組的細(xì)胞增殖速率[（1.28±0.59）vs（0.73±0.28），P＜0.05]，兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2.（A）慢病毒轉(zhuǎn)染HCT8和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞株。（B，C）MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測PVT1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。*P＜0.05

2.4 PVT1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲行為的影響

Transwell侵襲結(jié)果顯示(圖4A)：HCT8結(jié)腸癌細(xì)胞組si-PVT1組通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為181.52±13.24，多于NC組72.54±8.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SW620結(jié)腸癌細(xì)胞組si-PVT1組通過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為195.92±12.75，多于NC組62.5±7.17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 PVT1對(duì)結(jié)腸癌HCT8和SW620細(xì)胞侵襲能力的影響。*P＜0.05

2.5 PVT1對(duì)TGF-β信號(hào)通路激活的影響。

Western blotting免疫印跡法檢測PVT1對(duì)TGF-β信號(hào)通路蛋白的表達(dá)的情況。結(jié)果顯示（圖4A，B）：在HCT8和SW620細(xì)胞株中，在si-PVT1組中TGF-β、Smad2和α-SMA蛋白的表達(dá)水平相比Vector對(duì)照組顯著降低[TGF-β（1.19±0.15）% vs（0.19±0.05）%，P＜0.05；Smad2（1.35±0.18）% vs（0.28±0.08）%，P＜0.05；Smad2（1.38±0.16）% vs（0.26±0.07）%，P＜0.05]。結(jié)果表明，抑制PVT1后，TGF-β信號(hào)通路的相關(guān)蛋白的水平受到一定的抑制，表明PVT1可以通過調(diào)控TGF-β信號(hào)通路的激活，影響結(jié)腸癌細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)行為。

圖4 PVT1對(duì)TGF-β信號(hào)通路激活的影響

3.討論

過去腫瘤研究的方向是通過研究分子的化學(xué)抗性和細(xì)胞作用機(jī)制，這是治療晚期癌癥類型失敗的主要原因之一。然而，自21世紀(jì)以來，關(guān)于各種蛋白分子的相關(guān)進(jìn)展甚微。因此，新型分子特征的發(fā)現(xiàn)似乎在腫瘤表征中具有很大的前景，并且可以用作潛在的治療靶標(biāo)。為了確定lncRNA是治療惡性腫瘤潛在分子生物標(biāo)志物及與下游相關(guān)蛋白通路的功能相關(guān)性，本研究結(jié)果針對(duì)PVT1通過與TGF-β結(jié)合并激活信號(hào)通路的活性表達(dá)，從而調(diào)節(jié)腫瘤生長及細(xì)胞生長行為。

研究表明基因過度擴(kuò)增和PVT1的陽性診斷率有直接的關(guān)聯(lián)，可以導(dǎo)致惡性腫瘤的預(yù)后結(jié)果較差。盡管目前診斷l(xiāng)ncRNA的靶向治療仍然是臨床輔助治療，不算做標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但對(duì)化療藥物獲得性耐藥的存在是一個(gè)嚴(yán)重的問題，通過對(duì)抵抗機(jī)制的研究理解可能有助于克服臨床化療耐藥抵抗的難題。

LncRNA PVT1最近被證實(shí)是非小細(xì)胞肺癌和胃癌中的致癌基因，但未報(bào)道在結(jié)腸癌中的表達(dá)。在這項(xiàng)研究中確定了PVT1的表達(dá)水平，并研究了其在結(jié)腸癌中的功能作用。與先前的報(bào)道一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PVT11在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤生長活性。本實(shí)驗(yàn)通過研究下游蛋白通路靶點(diǎn)的激活情況，推測PVT1通過介導(dǎo)TGFβ參與結(jié)腸癌的侵襲和遷移過程，從而促進(jìn)腫瘤增殖，抑制細(xì)胞凋亡和發(fā)展，可以參照這一分子特性，進(jìn)一步探討PVT1分子在臨床化療治療過程的參與機(jī)制。Shi等學(xué)者研究報(bào)道抑制TGF-β通路蛋白的活性可以有效減少乳腺癌小鼠模型的肺轉(zhuǎn)移，并降低CCL5蛋白的表達(dá)。通過本實(shí)驗(yàn)研究推測，TGF-β被PVT1調(diào)控后可能對(duì)PVT1功能有一定反向影響，表明PVT1通過靶向TGF-β調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)活性有一定的實(shí)驗(yàn)推論。

最近相關(guān)證據(jù)表明，lncRNAs可以作為染色質(zhì)修飾復(fù)合物的支架，并作為響應(yīng)DNA損傷的信號(hào)，表明lncRNAs的調(diào)節(jié)功能依賴于其相互作用的蛋白質(zhì)。TGF-β是具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄共激活因子，其被證明對(duì)組蛋白乙?；苤匾?。最近，據(jù)報(bào)道lncRNA的部分亞型與TGF-β結(jié)合，通過修飾組蛋白乙?；瘉碛绊懟虮磉_(dá)。在本研究中，我們驗(yàn)證了PVT1可以調(diào)控TGF-β的表達(dá)，進(jìn)一步激活TGF-β信號(hào)通路。最后，我們將進(jìn)一步探討了PVT1在結(jié)腸癌患者中的潛在轉(zhuǎn)化應(yīng)用。