鄭巧靈， 張建勇， 張文雄， 梁永剛， 喻東亮， 魏益平， 徐建軍

南昌大學第二附屬醫(yī)院胸心外科(江西南昌 330008)

肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其病死率均居惡性腫瘤首位[1-2]。有研究表明I～II期肺癌患者的5年生存率明顯高于Ⅲ～Ⅳ期，但由于大約65%肺癌患者確診是已經(jīng)為晚期，這部分患者的5年生存率僅為5%左右，從而導致肺癌的總體5年生存率約為10%～18%[3]。因此，提高肺癌的早期診斷率是改善肺癌預后的關鍵。目前臨床上，肺癌早期診斷仍以傳統(tǒng)的X線、細胞CT、痰脫落細胞及支氣管鏡等方法為主，近年來，肺癌的早期診斷在影像學、支氣管鏡檢查和分子標志物檢測等方面取得了一定的進展，但有研究表明，目前主流的肺癌早期篩查方法應用于肺癌的篩查并不能降低肺癌的病死率[4]。痰液中含有與肺部疾病相關的分子信息，在大部分肺部疾病中，如肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺炎及肺癌等，痰液檢測是診斷或鑒別這些疾病非常有效的的方法[5]。但目前由于敏感度低、可重復性差等缺點，痰液檢測在臨床中肺癌診斷和篩查方面的運用受到了極大的限制[6]。因此，開發(fā)一種敏感度高、特異度強、可重復的肺癌篩查新方法顯得尤為重要。質(zhì)譜分析(MS)技術是一種敏感度高、特異度好、響應速度快的現(xiàn)代分析測試技術[7]。中性解吸電噴霧電離質(zhì)譜技術(ND-EESI-MS)方法是適用于黏稠的復雜基質(zhì)，已運用于蜂蜜、牙膏及化妝品等黏稠物的分析[8]。本研究運用ND-EESI-MS耦合最小偏二乘法(PLS)鑒別肺癌痰液及非肺癌痰液。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)南昌大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會認證，連續(xù)收集2016年1—6月同一治療組符合納入標準的患者，肺部疾病患者留痰液標本前未使用任何藥物；每例患者留取痰樣前空腹8 h以上；取樣時先用生理鹽水漱口2次；留取患者晨起第一口深部痰，所留取痰樣置于-80℃保存。入選患者根據(jù)手術后病理結(jié)果分為肺癌組和對照組，其中肺癌組67例，年齡41～78歲，其中鱗癌27例、腺癌35例、5例腺鱗癌。對照組(良性肺疾病及健康者痰液)43例，年齡24～75歲，其中肺炎5例、支氣管擴張的13例、9例慢性阻塞性肺疾病及健康人16例。

納入標準：(1)肺癌組，以肺癌診斷入院，留取入院次日痰液，手術中病理確診為肺癌。(2)對照組(良性肺疾病及健康者痰液)，手術病理為肺部良性疾病患者或排外惡性腫瘤患者及健康對照組，生理鹽水漱口后留取晨起第一口深部痰。

1.2 材料 ND-EESI離子源(ZL201610079585.X)[9]；LTQ-XL增強型線性離子阱質(zhì)譜儀，配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Finnigan公司)；KQ3200型超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。甲醇(色譜純, 美國Fisher Scientific公司)；醋酸 (分析純 上海試劑化學有限公司)；實驗用水為2次去離子水。

1.3 ND-EESI-MS分析 痰液的ND-EESI-MS分析方法：痰液樣品未經(jīng)任何處理，解凍后直接置于樣品管中進行分析。設置ND-EESI離子源為正離子模式，質(zhì)量范圍50～500 Da；離子傳輸管溫度150℃；噴霧電壓3.5 kv；透鏡電壓60.00 v；電噴霧氮氣壓力0.4～0.6 Mpa，解吸氮氣壓力3.2 Mpa，其他條件系統(tǒng)自動優(yōu)化，具體參數(shù)細節(jié)示意圖(圖1)。

萃取液在電噴霧氣體和高電壓作用下霧化并發(fā)生電離產(chǎn)生“帶電霧滴”。痰液樣本在中性解吸裝置中(圖示左下部分)高壓解吸氣體的作用下，解吸出痰樣中的中性有形成分，經(jīng)進樣噴頭到達“電噴霧萃取區(qū)”與其中的“帶電霧滴”混合，發(fā)生實時“液-液微萃取”和電離，從而使樣本中解吸出來的中性分子形成帶電微粒進入質(zhì)譜儀中檢測質(zhì)荷比(m/z)得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 ND-EESI-MS示意圖

1.4 ND-EESI-MS指紋譜圖的PLS分析及相對豐度的統(tǒng)計學分析 將ND-EESI-MS所記錄的痰液樣品的質(zhì)譜指紋譜圖的相對豐度數(shù)據(jù)導出，并將數(shù)據(jù)整理為每行代表1個樣本，每列代表1個質(zhì)荷比(m/z)值的矩陣X。用Matlab Toolbox進行PLS分析結(jié)果，上述數(shù)據(jù)處理方法均在Matlab7.8中編程實現(xiàn)。離子的相對豐度統(tǒng)計學分析均在SPSS 21.0 中完成。

2 結(jié)果

2.1 痰液ND-EESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜 采用ND-EESI-MS技術，在正離子模式下，通過實驗能得到肺癌者痰液、良性肺疾病者痰液及健康者痰液樣品的一級質(zhì)譜指紋圖譜，通過對比發(fā)現(xiàn)，良性肺疾病者痰液與健康者痰液樣本一級質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)無明顯差異，故將良性肺疾病者痰液與健康者痰液定義為對照組，與肺癌者痰液樣本進對比分析，通過比較兩組痰液樣品的指紋圖譜，可見兩組樣本指紋圖譜在m/z99.99，m/z115.00，m/z171.83，m/z207.97，m/z250.81，m/z274.39， m/z278.87，m/z318.37，m/z346.30，m/z348.10，m/z374.37，m/z376.15，m/z390.42等處的質(zhì)譜峰的信號強度有較明顯的差異。見圖2。

A：肺癌組痰液，質(zhì)譜指紋離子以m/z115.00，m/z250.81，m/z274.39，m/z278.87，m/z318.37，m/z348.04，m/z376.15，m/z390.42為主；B：對照組痰液，質(zhì)譜指紋主要離子為m/z99.99，m/z115.00，m/z171.83，m/z207.97，m/z274.23，m/z278.98，m/z318.26，m/z346.30，m/z348.10，m/z374.37，m/z390.34等。

圖2肺癌痰液及對照組痰液一級質(zhì)譜指紋圖譜

2.2 痰液ND-EESI-MS質(zhì)譜指紋PLS分析結(jié)果 將肺癌組與對照組(肺良性疾病組及健康組)痰液ND-EESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜進行PLS分析，發(fā)現(xiàn)兩組樣本一級質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)能夠明顯區(qū)分(圖3-A、B、C)，根據(jù)對區(qū)分的離子貢獻結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)其中主要的差異性物質(zhì)是m/z238、m/z251、m/z274、m/z279、m/z348、m/z374、m/z379和 m/z391之間的相對豐度差異最為明顯，見圖3-D。

2.3 比較兩組樣本中差異性離子的相對豐度 對PLS分析發(fā)現(xiàn)的差異性離子相對豐度進行對比分析，發(fā)現(xiàn)m/z238、m/z279、m/z348及m/z379在肺癌患者痰液中的相對豐度明顯高于對照組痰液(均P<0.05)，而m/z251及m/z391在肺癌患者痰液中的相對豐度明顯低于對照組痰液(均P<0.05)。m/z274及m/z374的相對豐度在兩組痰液樣本中無明顯差異(均P>0.05)。見表1、圖4。

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，早期肺癌患者生存率明顯優(yōu)于中晚期患者，但目前2/3左右患者診斷時已為晚期，提高早期診斷率是目前急需解決的問題[1]。目前肺癌的診斷方法主要是傳統(tǒng)的X線、胸部CT、血液檢驗、痰脫落細胞及支氣管鏡等方法，但這些方法或多或少存在一定缺陷，如影像學檢查有輻射、血液檢查及支氣管鏡因為有創(chuàng)性而難以被人們接受，而痰液脫落細胞則因為敏感性低而無法推廣，且有研究表明，傳統(tǒng)的肺癌診斷方法因依從性差對降低肺癌病死率貢獻有限[4]。痰液及呼出氣體都是無創(chuàng)診斷肺部疾病的理想樣本，但呼出氣體存在不易收集及運輸?shù)娜秉c，因而在無創(chuàng)診斷肺部疾病方面，痰液具有巨大優(yōu)勢因痰液富含與肺部疾病發(fā)生、發(fā)展相關的生物學信息，但由于敏感度低、可重復性差等缺點，痰液在肺癌診斷和篩查方面的臨床運用受到了極大的限制[6,10-11]。

A：在LS1及LS2上的2D模式 PLS結(jié)果；B：在LS1及LS3上的2D模式 PLS結(jié)果； C：3D模式 PLS結(jié)果；D：主要差異性物質(zhì)載荷圖

離子肺癌組對照組P值m/z2380.73±0.4250.22±0.143<0.05m/z2794.44±1.0403.36±1.425<0.05m/z3489.64±1.5773.73±1.494<0.05m/z3790.73±0.4250.22±0.143<0.05m/z2512.10±1.6145.07±3.148<0.05m/z3914.06±1.9928.88±1.746<0.05m/z2742.47±0.9862.26±1.396>0.05m/z3740.04±0.0990.08±0.174>0.05

兩組比較*P<0.05

質(zhì)譜分析(MS)技術是一種敏感度高、特異度好、響應速度快的現(xiàn)代分析測試技術。質(zhì)譜分析技術是主要是利用電場和磁場控制帶電粒子的運動軌跡，并能根據(jù)粒子的質(zhì)量及帶電量將不同的帶電粒子區(qū)分開(即質(zhì)量與帶電量比值相等的粒子會到達同一檢測區(qū)域)，然后檢測器能夠獲取粒子信息，從而獲得帶電粒子質(zhì)譜指紋圖譜。根據(jù)質(zhì)譜指紋圖譜的結(jié)果，可以分析出物質(zhì)的質(zhì)核比信息從而實現(xiàn)對待測物中某些粒子的定性與定量分析，已廣泛應用于惡性腫瘤的診斷、分子標志物檢測等領域。ND-EESI-MS[12]能夠運用于黏稠液體的直接分析，已成功運用于牙膏、蜂蜜、化妝品等黏稠液體的分析。前期研究發(fā)現(xiàn)ND-EESI-MS能夠?qū)μ狄哼M行直接分析并得到其內(nèi)部的分子生物學信息[10]，本研究在前期研究基礎上，對肺癌患者痰液及對照組痰液進行直接分析，以期發(fā)現(xiàn)肺癌痰液中與肺癌發(fā)生、發(fā)展相關的分子生物學信息。

應用ND-EESI-MS技術耦合PLS分析能夠明顯去區(qū)分兩組樣本一級質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)，且發(fā)現(xiàn)離子m/z238、m/z251、m/z274、m/z279、m/z348、m/z374、m/z379和 m/z391對區(qū)分兩組樣本的貢獻較大。對比發(fā)現(xiàn)離子m/z238、m/z279、m/z348及m/z379在肺癌組痰液中的相對豐度明顯高于對照組痰液，而離子m/z251及m/z391在對照組痰液中明顯高于肺癌患者痰液，離子m/z274及m/z374的相對豐度在兩組痰液樣本中無明顯差異。

運用ND-EESI-MS技術耦合PLS分析方法可以良好區(qū)分肺癌痰液與對照組痰液質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)并識別對區(qū)分貢獻度大的差異性離子，可作為肺癌痰液鑒別的新方法，以期能在未來用于肺癌的診斷或篩查。但本研究僅找出差異性離子且樣本量不是非常大，差異性離子的分子結(jié)構(gòu)及差異性離子的生物學意義仍需進一步研究。