高英健，鄭雨杭，張琴林，侯鈺穎，李 萌，李鴻信，方天一，呂偉興，趙文超，王紹輝

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

根結(jié)線蟲(chóng)(Root-knot Nematode, RKN)是植物根系內(nèi)寄生線蟲(chóng)，包括爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynejavanica)，南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincongnita)，花生根結(jié)線蟲(chóng)(MeloidogynehaplaChitwood)和北方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynehapla)等，第二階段幼蟲(chóng)(J2s)從土壤中的卵孵化，必須找到合適的宿主，機(jī)械穿透植物根部，并遷移到維管束組織以完成其生命周期，給生產(chǎn)帶來(lái)很大的損失[1]。

近年來(lái)，關(guān)于根結(jié)線蟲(chóng)染色方法的報(bào)道有很多，如酸性品紅染色觀察根組織[2];甲苯胺藍(lán)[3]或番紅-固綠對(duì)染染色觀察巨細(xì)胞[4];但是這些染色方式均針對(duì)于死亡的線蟲(chóng)。對(duì)活體幼蟲(chóng)標(biāo)記所用的染料有異硫氰酸熒光素[5]和熒光素二乙酸酯[6]。本文作者選用的是異硫氰酸熒光素，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素，最大吸收光波長(zhǎng)為490～495 nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520～530 nm，在藍(lán)光或紫外光照射下發(fā)出黃綠色熒光。

在之前的研究中，F(xiàn)ITC對(duì)活體線蟲(chóng)的標(biāo)記緩沖液的濃度過(guò)高，造成線蟲(chóng)的死亡率較高，本文作者對(duì)FITC染液的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，提升了線蟲(chóng)的存活率，可為侵染試驗(yàn)提供更有活力的熒光標(biāo)記線蟲(chóng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和主要試劑設(shè)備

試驗(yàn)所采用的材料為南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)和番茄CM野生型株系(Solanumlycopersicumcv Castlemart)。

試驗(yàn)中所需的試劑：FITC、章魚(yú)胺鹽酸鹽、間苯二酚、Sucrose、MS Powder、NaOH、植物凝膠、Pluronic凝膠。

試驗(yàn)中所需的設(shè)備：熒光體式顯微鏡(ZEISS，Discovery.V20)、恒溫培養(yǎng)箱、光照培養(yǎng)箱、電子天平、高溫滅菌鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南方根結(jié)線蟲(chóng)的繁育 根結(jié)線蟲(chóng)自繁方法如下：用于繁殖根結(jié)線蟲(chóng)的株系為易感株系。待植株長(zhǎng)到4～5片葉時(shí)，將其移栽至20 cm的裝有病土的營(yíng)養(yǎng)缽中，病土和營(yíng)養(yǎng)缽在使用前需要消毒。接種35～50 d時(shí)，觀察到其根部有大量淡黃色的卵塊時(shí)，取出長(zhǎng)有卵塊的根系。小心的將根系用清水洗干凈，挑取上面的卵塊，將挑取的卵塊放入1%的NaClO溶液中消毒30 s，之后用去離子水沖洗3次。再將卵塊放入適量的去離子水中，放至26 ℃恒溫箱中孵化2～3 d，收集已孵化出的J2，并計(jì)算其密度，用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.2 番茄幼苗的培育 將番茄種子放入滅過(guò)菌的50 mL離心管中，加入適量的滅菌水，放入37 ℃搖床中搖晃6 h。然后在超凈工作臺(tái)中將種子用75%乙醇消毒3 min，4%次氯酸鈉消毒8 min，再用滅菌水洗6～8次，將種子放入1/2 MS培養(yǎng)基中鋪平，生長(zhǎng)7～10 d。

1.2.3 線蟲(chóng)熒光標(biāo)記條件的設(shè)定 前人采用的標(biāo)記緩沖液濃度為(FITC:0.1 mg/mL、0.5%間苯二酚、30 mmoL章魚(yú)胺鹽酸鹽)染色時(shí)間為6 h[7]，在此基礎(chǔ)上設(shè)置不同的染液濃度，如表1。

將J2浸入不同濃度的FITC染液中，在黑暗條件下培養(yǎng)3、4和6 h，將染色的線蟲(chóng)同染液一起過(guò)孔徑76 μm的篩子，用清水沖洗幾遍，之后將篩子上的線蟲(chóng)洗脫至培養(yǎng)皿中，將洗脫的線蟲(chóng)置于熒光體式顯微鏡下觀察其顯色情況，6次重復(fù)。

表1 FITC標(biāo)記緩沖液濃度梯度Tab.1 FITC labeled buffer concentration gradient

1.2.4 存活率的統(tǒng)計(jì) 將染色后的線蟲(chóng)吸取20 μL放在培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下，分別統(tǒng)計(jì)20 μL里存活的線蟲(chóng)數(shù)量與總共的線蟲(chóng)數(shù)量，每個(gè)梯度和時(shí)間點(diǎn)做20個(gè)重復(fù)，選取最集中的數(shù)值按以下公式計(jì)算。方差分析采用Duncan’s多重比較法(P<0.05)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。存活率=存活線蟲(chóng)數(shù)/總線蟲(chóng)數(shù)。

1.2.5 Pluronic凝膠法觀察線蟲(chóng)的入侵 Pluronic凝膠溶液的配制方法為：23 g Pluronic粉末融入100 mL滅菌水中，4 ℃持續(xù)振蕩24 h，待其全部溶解，4 ℃保存。

將標(biāo)記后的線蟲(chóng)(約30頭)懸浮液加入預(yù)先分裝的Pluronic凝膠中，靜置5 min，使J2均勻分布于凝膠中，再將番茄幼苗根部放置于凝膠中，并放置于26 ℃培養(yǎng)箱中。24 h后在熒光體視顯微鏡下觀察根系線蟲(chóng)的入侵情況。

圖1 Pluronic凝膠中線蟲(chóng)侵染番茄植株根系示意圖Fig.1 Schematic diagram of tomato plant rootsinfected by nematodes in Pluronic gel

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲(chóng)存活率統(tǒng)計(jì)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，線蟲(chóng)標(biāo)記3 h時(shí)，D濃度下存活率為78%、E濃度下存活率為95%、F濃度下存活率為97%，存活率相對(duì)較高，標(biāo)記4 h后，線蟲(chóng)在C濃度下存活率為23%、D濃度下存活率為33%、E濃度下存活率為78%、F濃度下存活率為90%，雖然仍有存活，但存活率顯著下降，在A、B濃度存活率接近0。標(biāo)記6 h后，所有濃度的線蟲(chóng)接近死亡狀態(tài)。

表2 不同標(biāo)記時(shí)間和不同F(xiàn)ITC標(biāo)記緩沖液濃度梯度下線蟲(chóng)存活率

Tab.2 Nematode survival rates at different labeling times and different FITC labeled buffer concentration gradients

緩沖液存活率6 h4 h3 hA0.02±0.016a0.04±0.02 c0.17±0.06dB0.018±0.008a0.05±0.02c0.26±0.02 cdC0.017±0.010 a0.23±0.06c0.30±0.03 cD0.025±0.016 a0.33±0.04b0.78±0.07 bE0.013±0.08 a0.78±0.02 a0.95±0.03 aF0.024±0.015 a0.90±0.04 a0.97±0.02 a

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate statistically different variations atP<0.05.

2.2 不同染液體系和染色時(shí)間所標(biāo)記的線蟲(chóng)熒光強(qiáng)弱的觀察

線蟲(chóng)在濃度A-F的條件下標(biāo)記6 h后觀察，在A,B濃度條件下，線蟲(chóng)熒光較亮(圖2，A6h和B6h)，在F濃度下線蟲(chóng)的熒光亮度極其微弱。在縮短染色時(shí)間后，線蟲(chóng)的存活率雖有明顯的上升，但是線蟲(chóng)標(biāo)記的亮度會(huì)相應(yīng)的減弱，標(biāo)記3 h與4 h比較線蟲(chóng)的熒光顯色情況，E濃度下線蟲(chóng)顯色較明顯，存活率也相對(duì)較高。同時(shí)在E濃度條件下標(biāo)記線蟲(chóng)3 h與4 h的熒光顯色亮度相近(圖2，E3h和E4h)，但標(biāo)記3 h的線蟲(chóng)存活率較高，達(dá)到95%。綜合所有條件，最終確定FITC:0.025 mg/mL、0.25%間苯二酚、15 mol/L章魚(yú)胺鹽酸鹽的緩沖液濃度，線蟲(chóng)標(biāo)記3 h是最優(yōu)的熒光標(biāo)記條件。將最優(yōu)條件下標(biāo)記的線蟲(chóng)注入番茄幼嫩根系旁，發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記后的線蟲(chóng)可以從根尖進(jìn)入植株根系(圖3)，仍具有入侵的能力，引起根尖的膨大。

A、B、C、D、E、F分別表示緩沖液A-F濃度下標(biāo)記的線蟲(chóng)，n=6；Bar:10 μm圖2 FITC標(biāo)記南方根結(jié)線蟲(chóng)J2顯微觀察結(jié)果A, B, C, D, E, and F represent the nematodes labeled under the buffer A-F concentration, respectively, n=6; Bar: 10 μmFig.2 Microscopic observation of FITC-labeled M. incognita J2

3 討 論

FITC的應(yīng)用十分廣泛，是一種常用的熒光探針，主要用于標(biāo)記多糖、多肽等[8]，對(duì)線蟲(chóng)的染色試劑有很多，例如甲苯胺藍(lán)，番紅-固綠等，但是這些主要針對(duì)死線蟲(chóng)，對(duì)于活體線蟲(chóng)的標(biāo)記時(shí)，F(xiàn)ITC是主要的熒光染料。根據(jù)前人的研究，在染色緩沖液條件為:FITC: 0.1 mg/mL, 0.5%間苯二酚和30 mmoL章魚(yú)胺鹽酸鹽，染色6 h，線蟲(chóng)被標(biāo)記的熒光很亮[7]，但其未檢測(cè)存活率，我們?cè)谠摑舛认聵?biāo)記的線蟲(chóng)亮度和前人研究相一致(如圖2,A6h)，但線蟲(chóng)存活率很低，幾乎為0(如表2)，線蟲(chóng)存活是后續(xù)研究所需的最基本的條件，因此，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)降低FITC、間苯二酚、以及章魚(yú)胺鹽酸鹽的濃度和縮短染色時(shí)間，可以提高線蟲(chóng)的存活率。在表2中可以發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記線蟲(chóng)3 h的存活率較高。在保證線蟲(chóng)存活的條件下考慮標(biāo)記的亮度，因此舍棄了6 h的標(biāo)記時(shí)間以及a，b兩個(gè)緩沖液濃度。可以發(fā)現(xiàn)e濃度在標(biāo)記3 h、4 h的亮度相對(duì)較亮，因此，選擇了在e濃度標(biāo)記3 h作為最優(yōu)的標(biāo)記條件。在最優(yōu)的標(biāo)記條件下被標(biāo)記的線蟲(chóng)具有入侵植物根尖的活力。因此這個(gè)方法降低了染液濃度，縮短了染色時(shí)間，增加了線蟲(chóng)的存活率，減少了試劑的用量，可以用于靶向和沉默特定的線蟲(chóng)基因，以改變寄主植物的抗性[9]。

a、b、c、d表示線蟲(chóng)FITC:0.025 mg/mL、0.25%間苯二酚、15 mmoL章魚(yú)胺鹽酸鹽的緩沖液濃度標(biāo)記3 h的入侵情況，N:線蟲(chóng)，Bar:20 μm圖3 南方根結(jié)線蟲(chóng)J2s入侵情況顯微觀察 a, b, c, d represent the invasion of nematodes marked with FITC: 0.025 mg/ml, 0.25% resorcinol, 15mmoL octopamine hydrochloride for 3 h, N: nematodes;Bar:20 μmFig.3 Microscopy observation of the invasion of M. incognita J2s