祖 瑗，鐘小祥，李進強，劉曉柱，劉曉輝，黃名正，于志海*

（貴州理工學院 食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003）

特色果酒是指具有地域特色的非葡萄發(fā)酵酒。市場上現(xiàn)有無花果酒、刺梨酒、獼猴桃酒、桑葚酒、藍莓酒等特色果酒，但市場占有率都很小。特色果酒的小市場除了跟果酒的消費習慣有關外，其中一個很重要的原因就是當前果酒的低品質屬性。酵母是果酒釀造的靈魂，是決定果酒品質、口感和風味的重要因素。在當前小市場的特色果酒中，幾乎全是采用商業(yè)化的葡萄釀酒酵母發(fā)酵而來，而未見利用特色果酒專用酵母進行釀制而成。在生態(tài)進化過程中，特色水果與自身酵母之間經(jīng)過了長期的自然選擇，是最佳搭檔。只有將這些最佳搭檔篩選出來，應用于生產(chǎn)中才有可能推動特色果酒產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質發(fā)展。因此優(yōu)質酵母菌株的篩選和培育是果酒釀造的核心技術，也是制約特色果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大科學問題。值得慶幸的是，國內(nèi)外（特別是國內(nèi)）同行在特色果酒專用酵母方面的選育工作從未止步，近10年來有不少特色果酒專用酵母的選育報道。本文主要基于國內(nèi)近10年來的特色專用酵母的選育結果，結合當前市場的生產(chǎn)實際和研究熱點，將當前國內(nèi)同行們的研究結果作一整理，以期為未來特色果酒專用酵母的選育提供參考。

1 漿果果酒專用酵母的篩選與鑒定

漿果是一類多汁肉質單果的統(tǒng)稱，由單心皮或多心皮合生雌蕊形成，含一粒至多粒種子。這類果實種類較多（如葡萄、獼猴桃、藍莓等均屬于此類果實），因多汁肉質，適合釀造果酒（如釀酒葡萄）。

與葡萄的農(nóng)藝性狀最接近的漿果當屬藍莓，具有豐富的糖含量和高出汁率、果實大小與釀酒葡萄類似[1]，適宜于果酒釀造。伍鶴等[2]從藍莓成熟果實、藍莓葉及藍莓果園的土壤中篩選到了最優(yōu)菌株，鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），該菌株起酵快、發(fā)酵能力強、香氣濃郁、風味佳。任春光等[3]從藍莓自然發(fā)酵汁中分離到了4株發(fā)酵性能較好的酵母菌，這4株菌發(fā)酵平穩(wěn)，酒香和果香配比恰當，酸味適中，藍莓果酒味濃郁。李丹等[4]從藍莓自然發(fā)酵旺盛期的醪液中分離篩選到了1株粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeY201505），可產(chǎn)酒精度8%vol。陳小玲[5]從藍莓的成熟果皮及自然發(fā)酵的醪液中分離純化到73株野生菌株，經(jīng)逐級篩選，并與安琪商業(yè)酵母進行對比，選出1株發(fā)酵性能優(yōu)、乙醇耐受性高、SO2耐受性好的菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），同時對該菌株的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)、最佳澄清劑、果酒穩(wěn)定性等做了較為深入的研究。

桑葚是另一種近年來在專用酵母選育方面研究得較多的果品。當前公開報道的可用來進行桑葚果酒發(fā)酵的菌株約6株（見表1）。趙祥杰等[6]以成熟的桑葚果實、桑葉和桑果園土壤為分離源，篩選到了1株優(yōu)良菌株，該菌株起酵快，能耐高濃度的酒精和SO2，可產(chǎn)生酒精度為11.7%vol的果酒。趙祥杰等[7]從桑椹成熟果實、桑葉以及桑果園的土壤中進行桑椹果酒專用酵母的篩選，得到1株發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌，該菌株能產(chǎn)生11.7%vol的桑葚果酒。潘訓海等[8]以桑葚果汁自然發(fā)酵液和桑果園土壤為分離源，分離到了1株優(yōu)良菌株，該菌株起酵快、發(fā)酵過程緩和、產(chǎn)香好，并進行了1 t放大試驗，結果顯示該菌株可作為桑葚果酒生產(chǎn)酵母。顏雪輝[9]從桑葚的生存環(huán)境中分離到了一株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，該菌株可發(fā)酵成酒精度為10.6%vol的桑葚原酒。曹倩雯等[10]以市售桑葚為分離源，從其自然發(fā)酵醪液中分離到42株酵母，經(jīng)過杜氏小管發(fā)酵法初篩、產(chǎn)酒精能力復篩和耐SO2和香氣活力值三級篩選，最終獲得最優(yōu)菌株，并采用18S rDNA法鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。孫時光等[11]從桑葚（Fructus mori）的自然發(fā)酵醪液中分離到了35株酵母菌，經(jīng)過三級篩選獲得了1株發(fā)酵性能優(yōu)且高級醇產(chǎn)量低的桑葚果酒酵母。該菌株產(chǎn)生高級醇為312.41mg/L，低于安琪商業(yè)化的葡萄酒酵母，并且具有較好的乙醇和SO2耐受性，經(jīng)18S rDNA鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表1 候選漿果專用酵母的發(fā)酵性能Table 1 Fermentability of candidate special yeasts for berry

獼猴桃是一類富含維生素C（vitamin C，VC）、維生素E（vitamin E，VE）、維生素K（vitamin K，VK）和類胡蘿卜素等營養(yǎng)成分的漿果[12]，一直以來都備受研究者的關注。周元等[13]以獼猴桃皮為原材料分離到2株酵母，其中一株發(fā)酵活力強，適合作為獼猴桃果酒發(fā)酵的主發(fā)酵菌株，而另一株發(fā)酵得到的果酒香氣獨特，香氣組分含量高，適合作為獼猴桃果酒發(fā)酵的輔助菌株。郝瑤等[14]從獼猴桃中篩選到了1株發(fā)酵能力好、果香酒香濃郁的菌株，經(jīng)26S rDNA鑒定為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。蔣成等[15-16]從獼猴桃中獲得了2個菌株，均鑒定為畢赤酵母（Pichia pastoris）。

近10年來，還有一些稀有漿果果品的專用酵母篩選報道。如崔鐵忠等[17]從柿子果皮及柿果園土壤中篩選出了1株適合柿子果酒釀造的酵母菌。左勇等[18]從無花果（Ficuscarica）的果皮和無花果果酒渣中分離到了41株酵母菌，經(jīng)過三級篩選最后獲得1株起酵快、產(chǎn)酒產(chǎn)香均較好的菌株。謝國芳等[19]從火龍果的自然發(fā)酵汁中利用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）顯色法篩選到了1株優(yōu)良酵母菌株，該酵母可耐受較高的糖濃度、SO2濃度和酒精度，可產(chǎn)生具有火龍果典型風味的果酒。周興偉[20]對樹莓專用酵母進行了分離研究，從樹莓中分離到了1株SO2耐受力好，產(chǎn)酒率高的優(yōu)勢酵母菌，但是與英聯(lián)馬利阿城酵母菌公司的酵母菌株相比，性能還不夠優(yōu)越。

2 梨果果酒專用酵母的篩選與鑒定

梨果是由合生心皮下位子房與花托、萼筒共同發(fā)育而成的肉質果，屬假果。蘋果、梨、山楂、枇杷等屬于該類果實。梨雖然沒有特殊的果香，但是其較高的出汁率和糖含量仍吸引了不少研究者的眼球。近年來有不少從梨果中篩選專用酵母的報道，從梨中分離到的酵母約有6株（見表2）。曹新志等[21]從梨的自然發(fā)酵液中分離到1個酵母菌株，該菌株在梨汁中發(fā)酵力強，產(chǎn)酒度較高，殘?zhí)禽^低，產(chǎn)香較好，完全可作獨立的發(fā)酵菌株使用。陳文學等[22]從腰果梨和果樹根部土壤中分離得到65株酵母菌，經(jīng)過篩選，最終確定一株最優(yōu)菌株，該菌株能耐300 mg/L的SO2。金磊[23]以梨的果皮和梨園土壤為分離源，分離到了2株特征酵母，包括發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和產(chǎn)香性能突出的東方伊莎酵母（Issatchenkia orientalis），并且以這兩株酵母為出發(fā)菌株，進行原生質體融合育種，最終獲得1個優(yōu)良融合子DJ02，該菌株具有發(fā)酵能力強、產(chǎn)香能力好的雙親優(yōu)點，為適合釀造梨酒的酵母菌株。劉根娣等[24]以冬果梨為富集培養(yǎng)基，從980株野生酵母中篩選分離到1株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2序列分析法鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。王東玉[25]從海棠果（Calophyllum inophyllum）中分離到了4株酵母，經(jīng)5.8S-ITS區(qū)的PCR/RFLP分析分別鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和路德類酵母（Saccharomycodes ludwigii）。其中菌株B20具有高耐受性和發(fā)酵性能，可作為海棠果的發(fā)酵專用酵母。石明楊[26]從沙果（Malus asiatica）的表面及發(fā)酵汁中分離到了1株優(yōu)良菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)的PCR/RFLP分析，鑒定為畢赤酵母（Pichia pastoris）。

表2 候選梨果專用酵母的發(fā)酵性能Table 2 Fermentability of candidate special yeasts for pome

3 核果果酒專用酵母的篩選與鑒定

核果是由單心皮雌蕊、上位子房形成的果實，亦有由合生心皮雌蕊或下位子房形成。桃、杏、胡桃等屬于該類果實。楊梅是近年來分離到的酵母較多的核果。杜晶等[28]從楊梅果園周邊環(huán)境及楊梅發(fā)酵醪中篩選到了4個菌株，這些菌株在產(chǎn)氣性能、色澤和風味方面都比較突出（見表3）。李艷等[29]從青梅（Vatica mangachapoi）中篩選到1株優(yōu)良菌株，該菌株能夠產(chǎn)生酒精度為11.9%vol的青梅果酒，但是其整個酒產(chǎn)品的性能不及葡萄酒酵母BV818，因此該菌株僅僅是一株具有改造潛能的青梅果酒酵母。張陳云等[30]從冬棗發(fā)酵液中篩選的釀酒酵母TN9#為出發(fā)菌，進行了紫外誘變育種研究，最終獲得一株優(yōu)良的冬棗果酒專用菌株，該菌株能產(chǎn)生12.8%vol的果酒，并且能耐18%vol的酒精度。蔣錫龍等[31]從成熟桃表面選育到了1株產(chǎn)酒產(chǎn)香能力達到釀酒生產(chǎn)要求的菌株，經(jīng)26S rDNA分子生物學手段鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。石明楊[26]從桃的表面及發(fā)酵汁中分離到了1株優(yōu)良菌株，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)的PCR/RFLP分析，鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。岑濤等[32]通過對從芒果果皮上分離到的6株酵母菌的分析發(fā)現(xiàn)，DTM9最適合于芒果果酒的釀造，經(jīng)26S rDNA序列鑒定為海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）。許程等[33]從櫻桃果園的土壤中篩選到了1株發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母，能耐250 mg/L的SO2，并能保留櫻桃酒的特征風味，經(jīng)18S rDNA鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。李凱等[34]從櫻桃中篩選到了1株適合于紅心火龍果發(fā)酵的專用酵母，經(jīng)18S rDNA序列鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

表3 候選核果專用酵母的發(fā)酵性能Table 3 Fermentability of candidate special yeasts for drupe

4 柑果果酒專用酵母的篩選與鑒定

柑果屬單果，特指蕓香科柑桔屬的果實類型。如橙、桔、柚等屬于該類果實。因這類果實含糖量較高，特征風味明顯，近年來有一些關于該類果實釀造果酒，并從柑桔類果實上篩選專用酵母的研究報道。游見明[35]從腐爛桔子中分離得到35株釀酒酵母，從中篩選出3株發(fā)酵性能較優(yōu)良的菌株。編號為F16的菌株在發(fā)酵性能及桔子酒的品質方面，總體表現(xiàn)最優(yōu)，可作為桔子酒發(fā)酵用菌種或桔子酒專用菌種選育的出發(fā)菌株。潘訓海等[36]以臍橙果汁自然發(fā)酵液和果園土壤為分離源，分離到了1株優(yōu)良酵母，該菌株起酵快、發(fā)酵過程緩和、產(chǎn)香好，可作為臍橙果酒發(fā)酵用酵母。王雪瑩等[37-38]從土壤、甜橙果實表面共分離到138株酵母菌，經(jīng)四級篩選后獲得了發(fā)酵性能優(yōu)良的2株酵母，均鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。賈瑞楠等[39]從橙汁發(fā)酵液中分離到了1株能產(chǎn)11.75%酒精的優(yōu)良菌株，該菌株能耐250 mg/L的SO2，經(jīng)18S rDNA鑒定為釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。張大為等[40]從柑橘自然發(fā)酵液中分離到1株產(chǎn)酒精能力和產(chǎn)香能力均較強的菌株，經(jīng)26SrDNAD1/D2區(qū)序列鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。陳清嬋等[41]比較分析了商業(yè)酵母FX10、安琪果酒酵母、高溫釀酒酵母和2株前期從柑橘中分離到的菌株JZ-1、JZ-2對柑橘果酒香氣成分的影響，結果發(fā)現(xiàn)JZ-2生香效果最好，安琪果酒酵母發(fā)酵橘子酒的香氣最豐富。

表4 候選柑果專用酵母的發(fā)酵性能Table 4 Fermentability of candidate special yeasts for citrus fruit

5 其他類果實專用酵母的篩選與鑒定

菠蘿是一類聚花果，具有獨特的風味，近年來亦有在該類果實上分離專用酵母的報道。胡月英等[42]從成熟的菠蘿表皮和果肉分離得到101株酵母菌，經(jīng)過篩選，最終選到一株最優(yōu)菌株，該菌株在SO2質量濃度為300mg/L、pH1.5、乙醇含量為19%時，均能產(chǎn)氣發(fā)酵。且對菠蘿汁的發(fā)酵能力強，菠蘿酒香氣濃郁?？镡暤萚43-44]從菠蘿中篩選到了1株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由于該菌株耐SO2能力僅為60 mg/L，經(jīng)原生質體紫外誘變育種后獲得1株性能較好的菌株H10-15，并進行了活性干酵母的研究。

表5 候選其他類果實專用酵母的發(fā)酵性能Table 5 Fermentability of candidate special yeasts for other fruits

6 結論與展望

特色果酒專用酵母的篩選、鑒定與培育是果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的核心問題。我國幅員遼闊，有很多特色水果，為特色果酒的釀造提供了豐富的原料。當前研究的特色水果種類較多，涉及漿果、梨果、核果、柑果等，幾乎含糖量較高的水果均有相關專用酵母分離的研究，研究程序一般遵循“三步篩選法”即TTC初選-發(fā)酵能力（杜氏管）復篩-菌株發(fā)酵試驗（三級篩選）即可篩選到具有一定功能的目標菌株，但是對于篩選到的菌株的生理生化性質、表觀性質等方面較全的研究極少見，影響果酒生產(chǎn)的核心信息如乙醇產(chǎn)量、SO2耐受性、乙醇耐受性等沒有完全刻畫（見表1～表5）。在微生物鑒定方面，單憑ITS、18S rDNA、26S rDNA等常規(guī)方法就可以鑒定到種的水平，作者認為證據(jù)是不充分的，要做得更充分準確，可能還得有掃描電鏡和比較基因組學證據(jù)（或不同看家基因序列的交互驗證）。另外，菌株研究的延續(xù)性欠佳。大部分菌株在發(fā)表后很難見到后續(xù)研究報道，本來很多文章所發(fā)表的菌株均有很好的發(fā)酵性能，但是由于其后續(xù)的基礎研究缺乏延續(xù)性，導致該菌株很難走到商業(yè)化這一步，這可能是當前國內(nèi)所篩選的酵母商業(yè)化率低的重要原因。雖然特色水果的專用酵母與水果本身是經(jīng)歷了長期的自然選擇而形成最佳配合關系，但是自然來源的菌種資源往往存在一定的缺陷，如乙醇產(chǎn)量不高、耐SO2性能欠佳、凝集性弱、高級醇產(chǎn)量高等問題，只要有相應水果來源的菌株，其相關性狀均可通過基因工程等手段解決，而當前研究在這方面投入精力做精細工作的很少。

實際上，在同一種水果的不同發(fā)育時期的微生物群落是有差異的。因此要想獲得性狀較佳的微生物資源，需要對水果上的菌種進行立體式的篩選，在不同發(fā)育時期、不同小氣候環(huán)境等條件下進行取樣，從其生長的土壤環(huán)境、果實發(fā)酵液中等進行取樣分析。當前的酵母分離中酒精的生產(chǎn)量不應該是唯一目標，產(chǎn)香、降酸、凝集性好等這些來源于非釀酒酵母的性狀也應該是科研人員的關注點，因為這些非釀酒酵母的專屬性跟釀酒酵母一樣，依然能夠影響果酒的風味和口感[45]。