丁 昊，于艷穎，凌宏志，宋 剛，平文祥，葛菁萍*

（1.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

豆醬是一類傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]，以大豆為主要原料，經(jīng)煮制、壓塊、制曲發(fā)酵制成。其中含有多種人體所需營養(yǎng)成分[2]，經(jīng)微生物發(fā)酵后使其容易被人體消化，并可改善人體腸道功能[3]。許多微生物在豆醬發(fā)酵過程中起著重要作用，包括芽孢桿菌、乳桿菌、霉菌、酵母菌等[4-5]，其中米曲霉（Aspergillus oryzae）是發(fā)酵過程中的主要微生物[6]。

王哲等[7]研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)豆醬制作工藝制曲時間長且受季節(jié)限制，通常需要2～4個月，后續(xù)為達(dá)到最佳風(fēng)味還需充分發(fā)酵3個月。雖然有文獻(xiàn)報道[8-9]，利用傳統(tǒng)方法制醬，控制發(fā)酵條件，使得醬發(fā)酵至成品的時間大大縮短，由180d縮短至50 d，但還是較酶法制醬時間長。何立濤等[10]研究發(fā)現(xiàn)，利用酶法制醬去除制曲步驟，可以使豆醬出品率提高20%。目前，用于制醬的商品酶制劑大多來源于青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、枯草桿菌（Bacillussubtilis）。CASTRO R J S D等[11]通過使用分離的米曲霉LBA01產(chǎn)生的蛋白酶對大豆分離蛋白進(jìn)行催化，結(jié)果顯示，該蛋白酶具有很好的催化活性；曾小波[12]通過研究兩株米曲霉蛋白酶在酸性條件下對大豆蛋白的水解能力，結(jié)果顯示，兩株米曲霉所產(chǎn)的蛋白酶均具有較強(qiáng)的水解能力，且均隨著pH值的升高，水解程度提高。目前，關(guān)于應(yīng)用米曲霉蛋白酶制醬的研究還未見報道。

本研究以傳統(tǒng)豆醬中篩選得到的米曲霉HDF-7為出發(fā)菌株，通過鹽析、凝膠過濾對其所產(chǎn)的蛋白酶進(jìn)行分離純化，利用純化后的蛋白酶對大豆蛋白進(jìn)行水解，分析蛋白質(zhì)的降解情況及氨基酸含量的變化，并將其應(yīng)用于豆醬的制作，為其在工業(yè)制醬的研究發(fā)展提供依據(jù)，同時促進(jìn)酶制劑市場的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

米曲霉HDF-7：黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室，分離自豆醬；大豆蛋白粉：淘寶商城；氫氧化鈉（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；鹽酸（分析純）：沈陽市派爾精細(xì)化工制品廠；氨水（分析純）：北京化工廠。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

查氏瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硝酸鈉2 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，瓊脂20 g/L，氯化鉀0.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物3 g/L，葡萄糖10 g/L，麥芽浸膏3 g/L，大豆蛋白胨5 g/L。

以上培養(yǎng)基pH值均自然，用蒸餾水配制，121℃高溫濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Air TECH超凈工作臺：蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；HQL300A柜式恒溫冷凍搖床：中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；TGL-16B臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BG-verMINI迷你垂直電泳儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司；L-8800氨基酸自動分析儀：日本HiTACHI公司；凝膠層析介質(zhì)Sephedex G-50：瑞典Amersham公司；732濕強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂：美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

將米曲霉HDF-7斜面于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，加入10 mL無菌生理鹽水，洗脫孢子。孢子懸液經(jīng)無菌擦鏡紙過濾于無菌三角瓶（含玻璃珠）中，28℃、300 r/min條件下振蕩0.5 h，孢子濃度調(diào)至107個/mL。

按1%的接種量將孢子懸液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 d，離心，上清液即為粗酶液，采用福林-酚試劑測定其蛋白酶活力[13]，重復(fù)測定3次。

1.3.2 蛋白酶的分離純化

采用不同飽和度的硫酸銨（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）對粗酶液進(jìn)行鹽析，確定最適硫酸銨飽和度；采用葡聚糖凝膠G-50層析法對硫酸銨鹽析沉淀進(jìn)行分離、純化；采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對純化的米曲霉HDF-7蛋白酶進(jìn)行檢測；回收純化后的單一蛋白條帶，送至上?；倒具M(jìn)行N端氨基酸測序，測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進(jìn)行比對，具體步驟參照文獻(xiàn)[14]。

1.3.3 蛋白酶水解大豆蛋白的研究

將2 g大豆蛋白粉加入10 mL去離子水中，50℃條件下水浴溶解10 min，然后加入5 mL蛋白酶酶液（40 U/mL），迅速混勻，反應(yīng)2 h。待反應(yīng)結(jié)束后，煮沸10 min，使蛋白酶完全變性失活。煮沸后樣品靜置、冷卻，10 000 r/min條件下常溫離心20 min，棄沉淀，取上清液待測，以不加酶液的樣品作為空白對照。

大豆蛋白質(zhì)降解分析：利用SDS-PAGE對酶解前后大豆蛋白成分的分子質(zhì)量大小的分布進(jìn)行比較。具體步驟參照文獻(xiàn)[15]。

氨基酸含量的變化：參照文獻(xiàn)[16]對732濕強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行前處理。取5 g處理后的樹脂于燒杯中，加入20 mL大豆蛋白水解液，37℃水浴振蕩1 h，棄樣液。去離子水清洗樹脂2～3次，樹脂中加入15 mL氨水（5 mol/L），37℃水浴振蕩10 min，取清液。氨水洗脫一次，融合兩次洗液并采用沸水浴蒸干。用0.02 mol/L HCl定容至50 mL，混勻，獲得樣品。以原鹽酸溶液為空白對照組，利用氨基酸自動分析儀進(jìn)行檢測。

1.3.4 酶法制醬初步研究

原料預(yù)處理：100 g大豆蛋白粉中加入15%的鹽水100 mL，充分?jǐn)噭蚝笥?21℃條件下高壓滅菌15 min。

豆醬的發(fā)酵：原料冷卻至40～45℃后，按照15 U/g原料加入純化的蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，保溫發(fā)酵。發(fā)酵3 d后升溫至50℃，繼續(xù)保溫發(fā)酵4 d，期間每天攪拌一次。

1.3.5 豆醬的感官評價

以曲法制得的豆醬（寶泉牌）作對照，邀請數(shù)位試吃人員對豆醬的色、香、味及發(fā)酵形態(tài)進(jìn)行整體性評價[17]。

1.3.6 豆醬理化指標(biāo)的測定

總酸的測定：參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；食鹽的測定：參照GB5009.42—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食鹽指標(biāo)的測定》；鉛的檢測：參照GB5009.12—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測定》；總砷的測定：參照GB 5009.11—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測定》；總氨基酸態(tài)氮的測定：參照GB/T5009.40—2003《醬衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；總黃曲霉毒素B1的測定：參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》。

1.3.7 豆醬微生物指標(biāo)的測定

大腸菌群的測定：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》；致病菌的測定：參照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》、GB4789.10—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.5—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗》。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶純化結(jié)果

2.1.1 （NH4）2SO4鹽析飽和度的確定

（NH4）2SO4沉淀蛋白酶的鹽析曲線見圖1。

圖1 蛋白酶硫酸銨鹽析曲線Fig.1 Salting-out curve of ammonium sulfate of protease

由圖1可知，隨著硫酸銨溶液飽和度逐漸上升，上清液中剩余酶活也逐漸降低，當(dāng)飽和度達(dá)到70%時，剩余酶活最低，為（3.34±0.24）U/mL，相對酶活為（13.53±0.96）%；當(dāng)飽和度達(dá)到80%時，剩余酶活為（3.39±0.25）U/mL，相對酶活為（13.73±1.01）%，變化不明顯，因此，硫酸銨沉淀蛋白酶的最佳飽和度是70%。

2.1.2 Sephadex G-50層析

利用Sephadex G-50對鹽析沉淀進(jìn)行層析，結(jié)果見圖2。

圖2 蛋白酶Sephadex G-50層析柱洗脫曲線Fig.2 Elution profile of protease on Sephadex G-50 column

由圖2可知，鹽析沉淀經(jīng)Sephadex G-50層析后得到洗脫峰1和2，根據(jù)層析原理可知，洗脫峰1的分子質(zhì)量大于洗脫峰2，對兩峰的收集液的蛋白酶活進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，酶活主要集中在洗脫峰1中，留存洗脫峰1的收集液以備后續(xù)檢測。

2.1.3 SDS-PAGE結(jié)果

將純化后的蛋白酶進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)染色脫色后得到圖3。

圖3 純化后蛋白酶的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE result of protease after purification

由圖3可知，洗脫峰1經(jīng)SDS-PAGE檢測后，為單一條帶，說明此蛋白酶已達(dá)到電泳純。根據(jù)蛋白質(zhì)Marker可推測，此蛋白酶分子質(zhì)量為30 kDa左右。

2.1.4 氨基酸序列分析

切下目標(biāo)條帶（30kDa）送至上?；倒具M(jìn)行N端氨基酸測序，得到含12個氨基酸的序列：GGGNDYVILNAQ。將此氨基酸序列在NCBI上比對后發(fā)現(xiàn)，其與米曲霉（Aspergillus oryzae）RIB40的中性蛋白酶（ACCESSION：AAT68480）的N端序列具有很高的相似度。

2.2 蛋白酶水解大豆蛋白的研究

2.2.1 大豆蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的分析

大豆蛋白主要是球蛋白，根據(jù)不同分子質(zhì)量可分為2S、7S、11S和15S四組[18]，其中以7S和11S為主。主要成分有胰蛋白酶抑制劑、細(xì)胞色素C、大豆凝集素、解脂酶、β-淀粉酶、7S球蛋白、11S球蛋白[19]。大豆蛋白經(jīng)水解后，產(chǎn)物以糖基化氨基酸和氨基酸為主。劉汝萃等[20]利用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白發(fā)現(xiàn)，酶解主要發(fā)生在7S和11S的酸性亞基上，但隨著酶解時間的延長，7S亞基條帶變化并不顯著。

利用純化的米曲霉蛋白酶HDF-7對大豆蛋白進(jìn)行水解，采用SDS-PAGE對水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解前后大豆蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE results of soybean protein before and after enzymatic hydrolysis

由圖4可知，根據(jù)蛋白分子質(zhì)量推測大豆蛋白經(jīng)米曲霉HDF-7蛋白酶酶解后，其中大豆凝集素、解脂酶及一些球蛋白被水解，而胰蛋白酶抑制劑和β-淀粉酶無明顯變化，且一些小分子蛋白也未被水解。

大豆凝集素是一種糖蛋白，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有凝集和促分裂的生物學(xué)活性，可由小腸上皮進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)而誘發(fā)免疫反應(yīng)，破壞機(jī)體正常代謝，導(dǎo)致小腸粘膜損傷，內(nèi)源氮的大量損失，體蛋白加強(qiáng)分解等一系列反應(yīng)[21]。本實驗提取的米曲霉HDF-7蛋白酶能有效水解大豆凝集素，阻止其抗?fàn)I養(yǎng)作用，使大豆蛋白營養(yǎng)成分更易被吸收，并大大減少對機(jī)體的不良影響。

2.2.2 氨基酸含量的變化

由于氨基酸是一種多官能團(tuán)分子，食用后可與風(fēng)味受體結(jié)合產(chǎn)生特定風(fēng)味。因此，豆醬中的游離氨基酸的種類和數(shù)量對其品質(zhì)顯得尤為重要[22-23]。利用732濕強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂提取大豆蛋白的水解產(chǎn)物，用氨基酸自動分析儀測定水解產(chǎn)物中各種氨基酸的含量，大豆蛋白酶解前后氨基酸種類的譜圖分別見圖5和圖6。酶解前后各種氨基酸含量的變化結(jié)果見表1。

圖5 大豆蛋白酶解前氨基酸分析色譜圖Fig.5 Chromatogram of amino acid analysis before enzymatic hydrolysis of soybean protein

圖6 大豆蛋白酶解后氨基酸分析色譜圖Fig.6 Chromatogram of amino acid analysis after enzymatichydrolysis of soybean protein

由表1可知，大豆蛋白經(jīng)米曲霉HDF-7蛋白酶酶解后，總氨基酸含量較酶解前增加18.2%，其中半胱氨酸、丙氨酸、纈氨酸、精氨酸含量明顯提高（P＜0.01）。立體構(gòu)型不同的氨基酸含有不同的味道[24]，丙氨酸含有很強(qiáng)的甜味，而精氨酸有苦味，纈氨酸有微甜但略苦的味道，因此，米曲霉HDF-7蛋白酶是一種有潛在應(yīng)用價值的生物催化劑。

表1 大豆蛋白酶解前后氨基酸含量的變化Table1 Changes of amino acid contents of before and after enzymatic hydrolysis of soybean protein

2.3 豆醬的感官評價

傳統(tǒng)豆醬色澤大體呈深紅或深棕褐色、醬體光亮細(xì)膩，醬香濃香綿柔，無不良刺激氣味，鮮味突出、咸甜適宜，粘稠適度、均勻、無雜質(zhì)。但是傳統(tǒng)豆醬制作耗時費工（20 d），因此，嘗試直接將純化的蛋白酶加入大豆豆粉中制醬，對其進(jìn)行感官評價，結(jié)果見表2。

表2 豆醬的感官品評結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of soybean sauce

由表2可知，與傳統(tǒng)的曲法制得的豆醬相比，酶法制得的豆醬呈醬褐色，口感適宜，咸而不膩，具有醬、酯香，且醬整體偏稀，鮮味也比較適中?？傮w來說，其風(fēng)味、外觀與傳統(tǒng)豆醬差別不大，但傳統(tǒng)曲法制醬耗時長，酶法制醬時間短（7 d），工藝較簡單。

2.4 豆醬理化指標(biāo)的測定

豆醬中總酸含量為1.78g/100g，符合國標(biāo)中總酸含量≤2.0 g/100 g的要求；食鹽含量為45 g/100 g，符合國標(biāo)中食鹽含量≥12.0 g/100 g的要求；鉛含量為0.02 mg/kg，符合國標(biāo)中鉛含量≤0.5 mg/kg的要求；總砷含量為0.1 mg/kg，符合國標(biāo)中總砷含量≤0.5 mg/kg的要求；總氨基酸態(tài)氮含量為0.97g/100g，符合國標(biāo)中氨基酸態(tài)氮含量≥0.3 g/100 g的要求；黃曲霉毒素B1含量＜5 μg/kg，符合國標(biāo)中黃曲霉毒素B1含量≤5 μg/kg的要求。

2.5 豆醬微生物指標(biāo)的測定

豆醬中大腸菌群呈陰性，符合國標(biāo)中大腸菌群量≤30 MPN/100 g的要求；未檢出沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等致病菌，符合豆醬中致病菌不得檢出的要求。

3 結(jié)論

采用鹽析法、凝膠過濾法分離純化得到米曲霉HDF-7蛋白酶，該蛋白酶對大豆蛋白水解后，大豆凝集素、解脂酶及一些球蛋白被水解，且總氨基酸含量較水解前增加18.2%，其中丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸和精氨酸的含量明顯提高。采用該蛋白酶制作的豆醬除粘著性不高，呈現(xiàn)稀態(tài)外，其風(fēng)味、外觀與傳統(tǒng)豆醬差別不大，理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合相關(guān)國標(biāo)要求，且大大縮短了制醬時間（7d），為其在工業(yè)制醬的研究發(fā)展中提供依據(jù)，同時對酶制劑市場的發(fā)展具有促進(jìn)作用。