遲乃玉，希 倫，劉 洋，于 爽，李美玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

膽固醇氧化酶是一種黃素蛋白的氧化還原酶，能催化膽固醇為膽甾-4-烯-3-酮和過氧化氫，是膽固醇代謝過程中的一個關(guān)鍵酶[1]。其廣泛應(yīng)用于血清、其他臨床樣品和食品中的膽固醇水平的測定[2-3]、殺蟲劑、許多甾醇和非甾醇的生物轉(zhuǎn)化等[4-6]。此外，該酶在膽固醇代謝、細菌發(fā)病機制以及大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素的生物合成等方面具有多種生物學(xué)作用[7-9]。

膽固醇氧化酶的生產(chǎn)方法有提取分離法、化學(xué)合成法、生物合成法等，其中生物合成法又有微生物發(fā)酵法與動植物細胞培養(yǎng)法。由于微生物具有多樣性、繁殖快速、易發(fā)生遺傳變異、胞外酶易分離純化，且產(chǎn)生的膽固醇氧化酶比動植物膽固醇氧化酶具有更寬的pH、反應(yīng)溫度范圍和底物特異性的優(yōu)勢[10]，因此，微生物膽固醇氧化酶是工業(yè)膽固醇氧化酶的重要來源。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)膽固醇氧化酶的菌株有假單胞菌屬（Pseudomonassp.）[11]、紅球菌屬（Rhodoccus sp.）[12]、諾卡氏菌屬（Nocardiasp.）[13]、節(jié)桿菌屬（Arthrobac teriumsp.）[14]、鏈霉菌屬（Strepromycessp.）[15]等。我國關(guān)于膽固醇氧化酶的研究雖然起步晚，但是進展快且得到了很有應(yīng)用價值的成果[16-17]。

本研究通過菌落染色法從海洋中分離篩選高產(chǎn)膽固醇氧化酶的細菌，采用分子生物學(xué)技術(shù)對其進行鑒定，并對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行單因素試驗優(yōu)化，為膽固醇氧化酶提供新的來源。最后通過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析法對其所產(chǎn)的膽固醇氧化酶進行分離純化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

海泥樣品：中國遼寧大連渤海海域附近（鹿島港，N：39°11′，S：121°35′；濱海路沿線N：39°7′，S：121°41′；蕎麥山橋，N：39°13′，S：121°42′）。

1.1.2 試劑

瓊脂、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）：吉林東博生物公司；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、4-氨基-安替比林（均為分析純）：北京賽德科技有限公司；膽固醇（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；辣根過氧化物酶（≥200 U/mg）：上海B-BI生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體富集培養(yǎng)基：膽固醇0.1%，NH4NO30.1%，KH2PO40.025%，MgSO40.025%，F(xiàn)eSO40.000 1%，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，膽固醇0.1%，吐溫-80 0.1%，瓊脂2%，NH4NO30.1%，KH2PO40.025%，MgSO40.025%，F(xiàn)eSO40.000 1%，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，膽固醇0.1%，吐溫-80 0.1%，NH4NO30.1%，KH2PO40.025%，MgSO40.025%，F(xiàn)eSO40.000 1%，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在121℃高溫滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GS-158低溫臺式離心機：美國BECKMAN公司；CH1015超級恒溫水浴槽：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；Inazge MlasterRVDS電泳成像系統(tǒng)：美國Parmacia Biotech公司；PB-10型精密pH計：上海精密儀器廠；DZF-6052真空干燥箱：上海風(fēng)棱實驗設(shè)備有限公司；HVE-50超高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的篩選

菌株初篩：將1g海泥樣品置于含有100 mL液體富集培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，在25℃條件下培養(yǎng)48 h，并用無菌水進行梯度稀釋（10-1～10-6）。將100 μL各梯度的稀釋液涂布于篩選固體培養(yǎng)基平板，并在25℃條件下倒置培養(yǎng)48h。選取不同形態(tài)的菌落，采用點種法接種于兩個新的平板上，其中一個平板進行菌落染色，即將一片濾紙浸入含有0.5%膽固醇、3 000 U/L辣根過氧化物酶、1.7%4-氨基-安替吡啶和6%苯酚的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）中，再將其平鋪在平板上，將平板在室溫下溫育24 h。由于醌亞胺染料的形成，通過測試菌落周圍形成的粉紅色的大小及顏色的深淺來評估膽固醇氧化酶活性的高低[18-19]。

菌株復(fù)篩：對初篩菌株的膽固醇氧化酶活力進行測定，篩選高產(chǎn)膽固醇氧化酶的菌株。

1.3.2 膽固醇氧化酶活力的測定[20]

以O(shè)D500nm值（x）為橫坐標，H2O2濃度（y）為縱坐標，繪制H2O2標準曲線。H2O2標準曲線回歸方程為y=0.413x-0.1279，R2=0.999 4，表明線性關(guān)系良好，可用于膽固醇氧化酶活力的測定。

粗酶液的制備：將篩選得到的菌落接種到種子培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，在25℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h。然后，將1 mL液體種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，在25℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液。

膽固醇氧化酶活力定義：在37℃、pH 7.5條件下，1 min催化1μmol膽固醇氧化成膽甾-4-烯-3-酮所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.3 菌種的鑒定

將膽固醇氧化酶活力最高的菌株送至寶生物工程（大連）有限公司進行16Sr DNA測序，測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genebank中進行BLAST比對，選取同源性較高的模式菌株，利用MEGA5軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵周期：按10%（V/V）的接種量將篩選菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100mL/250mL，在25℃、200r/min條件下進行發(fā)酵，每隔2 h取樣測定膽固醇氧化酶活性。

發(fā)酵溫度：將發(fā)酵培養(yǎng)基置于不同溫度條件下（20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）發(fā)酵24 h后，測定膽固醇氧化酶活性。采用單因素輪換法依次考察接種量（2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%）、初始pH值（5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6）、通氣量（在250 mL的錐形瓶中加入60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL、120 mL、130 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，放在轉(zhuǎn)速為100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)）對菌株產(chǎn)膽固醇氧化酶的影響。

在此基礎(chǔ)上，依次考察碳源種類（在培養(yǎng)基分別加入0.5%蔗糖、果糖、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、甘油）、氮源種類（以0.5%蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、硫酸銨、乙酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉及NH4NO3）、膽固醇含量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）對菌株產(chǎn)膽固醇氧化酶的影響。

1.3.5 膽固醇氧化酶的分離純化

硫酸銨沉淀：向粗酶液中緩慢加入細磨的硫酸銨，使飽和度為0～90%。4℃保存過夜，離心（10 000 r/min、30 min）后保留沉淀。將沉淀物懸浮在Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 7.0）緩沖溶液中，測定不同飽和度下膽固醇氧化酶的活性，并繪制硫酸銨鹽析曲線[21]。

透析：在4℃條件下，使用透析袋對樣品進行透析，期間不斷更換透析液，直至不再有SO42-殘留在透析液中。

超濾：將透析后的樣品加入超濾管中，離心（8000r/min、20 min）后取上清進行Sephadex G-100凝膠過濾層析。

凝膠過濾層析[22]：將Sephadex G-100填料裝入凝膠過濾柱中，加入2 mL超濾酶液，采用Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 7.0）緩沖溶液進行洗脫，洗脫速度為0.3 mL/min，收集時間為4 min。查看洗脫峰并測定相應(yīng)試管中樣品的膽固醇氧化酶活力。

純化的酶液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[23]進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)膽固醇氧化酶菌株的篩選

使用膽固醇作為唯一碳源，通過菌落染色法從海泥中篩選到83株能產(chǎn)生膽固醇氧化酶的菌株。通過復(fù)篩篩選到一株高產(chǎn)膽固醇氧化酶的菌株，編號為XLH059，其膽固醇氧化酶活力為0.407 U/mL。

2.2 菌株的鑒定

采用MEGA 5.05軟件中的NJ法構(gòu)建菌株XLH059的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，菌株XLH059與蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）聚于一支，同源性最高，為99%。因此，初步鑒定其為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖1 基于16S rDNA序列菌株XLH059的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain XLH059 based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株XLH059產(chǎn)膽固醇氧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵周期的確定

發(fā)酵時間對膽固醇氧化酶活性的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的推移，膽固醇氧化酶的活性呈先升高后下降的趨勢，在發(fā)酵26 h時達到最大酶活，為0.412 U/mL；發(fā)酵26 h之后，隨著發(fā)酵時間的延長，酶活性開始下降，分析原因可能是菌株進入衰退期，或營養(yǎng)不足。因此，24 h為最佳培養(yǎng)時間。

圖2 發(fā)酵時間對膽固醇氧化酶活力的影響Fig.2 Effect of fermentation time on cholesterol oxidase activity

2.3.2 發(fā)酵溫度對膽固醇氧化酶活力的影響

發(fā)酵溫度對膽固醇氧化酶活性的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，膽固醇氧化酶的酶活性呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為26℃時，達到最大酶活性，為0.431 U/mL；當(dāng)發(fā)酵溫度高于26℃之后，隨著發(fā)酵溫度的升高，酶活性開始下降。因此，26℃為最佳培養(yǎng)溫度。因其產(chǎn)酶菌株來源于海洋，生長溫度較低，所以較陸地來源微生物所產(chǎn)的膽固醇氧化酶，其在低溫環(huán)境下仍然能夠保持較高的酶活性[24]。

圖3 發(fā)酵溫度對膽固醇氧化酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on cholesterol oxidase activity

2.3.3 接種量對膽固醇氧化酶活力的影響

接種量對膽固醇氧化酶活性的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著接種量的增加，膽固醇氧化酶的酶活性呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)接種量為10%時，酶活性最大，為0.536 U/mL。因此，10%的接種量為最佳接種量。

圖4 接種量對膽固醇氧化酶活力的影響Fig.4 Effect of inoculum on cholesterol oxidase activity

2.3.4 初始pH值對膽固醇氧化酶活力的影響

初始pH值對膽固醇氧化酶活力的影響如圖5所示。由圖5可知，隨著初始pH值的升高，膽固醇氧化酶的酶活性呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)初始pH值為7.0時，達到最大酶活性，為0.583 U/mL。因此，最適pH值為7.0。

圖5 初始pH值對膽固醇氧化酶活力的影響Fig.5 Effect of initial pH value on cholesterol oxidase activity

2.3.5 通氣量對膽固醇氧化酶活力的影響

表1 通氣量對膽固醇氧化酶活力的影響Table 1 Effect of ventilation on cholesterol oxidase activity%

通氣量對膽固醇氧化酶活力的影響見表1。由表1可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時，不同裝液量條件下酶活力均最高，說明該轉(zhuǎn)速最適合膽固醇氧化酶的產(chǎn)出與積累；當(dāng)裝液量為100 mL/250 mL時，不同轉(zhuǎn)速條件下的酶活力均最高，說明該裝液量最適合膽固醇氧化酶的產(chǎn)出與積累。因此，選擇100 mL/250 mL的裝液量和200 r/min的轉(zhuǎn)速作為最優(yōu)發(fā)酵條件，在此條件下酶活性最大，為0.610 U/mL。

2.3.6 碳源種類對膽固醇氧化酶活力的影響

微生物的生長與碳源提供的能量是不可分離的，碳源是微生物生長不可缺少的營養(yǎng)素。不同碳源對菌株XLH059產(chǎn)膽固醇氧化酶活力的影響如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)碳源為葡萄糖時，膽固醇氧化酶活力最高，為0.657 U/mL。因此，確定葡萄糖為最佳碳源。

圖6 碳源種類對膽固醇氧化酶活力的影響Fig.6 Effect of carbon source types on cholesterol oxidase activity

2.3.7 氮源種類對膽固醇氧化酶活力的影響

微生物的生長與氮源提供的能量是不可分離的，氮源是微生物生長不可缺少的營養(yǎng)素。不同氮源對菌株XLH059產(chǎn)膽固醇氧化酶活力的影響見圖7。由圖7可知，當(dāng)?shù)礊榈鞍纂藭r，膽固醇氧化酶活力最高，為0.698 U/mL。因此，確定蛋白胨為最佳氮源。

圖7 氮源種類對膽固醇氧化酶活力的影響Fig.7 Effect of nitrogen source types on cholesterol oxidase activity

2.3.8 膽固醇含量對膽固醇氧化酶活力的影響

膽固醇是膽固醇氧化酶產(chǎn)生的誘導(dǎo)物，其在培養(yǎng)基中的含量直接影響膽固醇氧化酶的產(chǎn)量，膽固醇含量對膽固醇氧化酶活力的影響結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，隨著膽固醇含量的增加，膽固醇氧化酶活力呈先增加后穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)膽固醇含量為0.5%時，膽固醇氧化酶活力達到最高，為0.718 U/mL。因此，膽固醇的最佳含量為0.5%。

圖8 膽固醇含量對膽固醇氧化酶活力的影響Fig.8 Effect of cholesterol content on cholesterol oxidase activity

2.4 膽固醇氧化酶的分離純化

2.4.1 硫酸銨沉淀

硫酸銨鹽析曲線如圖9所示。由圖9可知，當(dāng)硫酸銨飽和度為85%時，上清液基本沒有酶活。因此，選擇最適硫酸銨飽和度為80%進行鹽析，收集沉淀物，然后進行透析和脫鹽。

圖9 硫酸銨鹽析曲線Fig.9 Salting out curve of ammonium sulfate

2.4.2 凝膠過濾層析

凝膠過濾層析結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，硫酸銨沉淀經(jīng)SephadexG-100凝膠柱層析后，一共有8個蛋白質(zhì)吸收峰。對收集液的酶活力進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有58至70個管的收集液具有膽固醇氧化酶活性。將收集的膽固醇氧化酶溶液儲存在4℃冰箱中并進行SDS-PAGE檢測。

圖10 Sephadex G-100凝膠過濾層析色譜圖Fig.10 Gel filtration chromatogram by Sephadex G-100

2.4.3 SDS-PAGE結(jié)果

由圖11可知，凝膠過濾層析后的樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測后，得到單一條帶，大小約為59 kDa，與預(yù)期大小一致。

圖11 膽固醇氧化酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.11 SDS-PAGE electrophoretogram of cholesterol oxidase

3 結(jié)論

本研究以膽固醇為唯一碳源，篩選出具有高膽固醇氧化酶活性的菌株XLH059，酶活力為0.407U/mL。菌株XLH059經(jīng)16S rDNA序列鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。通過發(fā)酵條件優(yōu)化確定菌株XLH059的最佳產(chǎn)酶條件：發(fā)酵周期24 h，發(fā)酵溫度26℃，接種量10%，初始pH值7.0，裝液量100 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速200 r/min，以葡萄糖、蛋白胨分別作為碳源和氮源，膽固醇含量0.5%。在此最優(yōu)條件下，膽固醇氧化酶活力為0.718 U/mL，是優(yōu)化前的1.76倍。該酶經(jīng)硫酸銨沉淀、透析超濾、凝膠過濾層析純化及SDS-PAGE凝膠電泳檢測后得到分子質(zhì)量約為59 kDa膽固醇氧化酶。該研究為膽固醇氧化酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的候選菌株，并為進一步研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。