楊雁華 湯建民 來桂棵 王豐云

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)是細胞和血液進行物質(zhì)交換的機械屏障，其內(nèi)分泌功能的改變或細胞損傷會導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的失衡，進而引發(fā)多種心血管疾病。作為多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化的發(fā)生機制十分復(fù)雜，HUVECs凋亡和損傷被認為是其形成的始動環(huán)節(jié)〔1〕。因此，如何改善HUVECs凋亡和損傷一直是防治動脈粥樣硬化的研究熱點。血管緊張素(Ang)Ⅱ是腎素-Ang系統(tǒng)中一種重要的血管活性因子，在誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡及損傷、增加內(nèi)皮細胞通透性、調(diào)控血管活性物質(zhì)分泌和血管收縮等方面發(fā)揮重要的作用，與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔2～4〕。正五聚蛋白(PTX)3又稱為腫瘤壞死因子刺激基因(TSG)14，是PTXs超家族中重要的急性期蛋白，PTX3能夠與多種可溶性配體相結(jié)合，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用〔5～7〕。研究〔8,9〕報道，PTX3參與了動脈粥樣硬化過程，但其對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs凋亡及血管活性物質(zhì)分泌的影響未見報道。本研究觀察PTX3在AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs中的表達，并通過生物學(xué)手段干預(yù)其表達后，從HUVECs增殖、凋亡及對血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素(ET)-1和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達的角度觀察PTX3對血管內(nèi)皮細胞的調(diào)控作用，以期為以PTX3為靶點的抗動脈粥樣硬化和心血管疾病治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs購于美國ATCC 細胞庫。青鏈霉雙抗購于美國 Hyclone公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，胰蛋白酶和 RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司。AngⅡ和噻唑藍(MTT)試劑購于美國Sigma公司。PTX3 siRNA和陰性對照序列購于美國Lafayette公司。Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司。PTX3抗體、β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記二抗購于美國Santa Cruz公司?？偟鞍滋崛≡噭┖?、總RNA提取試劑盒購于天根生化公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、二辛可寧酸(BCA)蛋白定量試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天公司。酶標儀購于瑞士TECAN公司，紫外分光光度計購于上海光譜儀器公司，流式細胞儀和細胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1.2細胞培養(yǎng)及AngⅡ處理 采用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基于5% CO2、37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)HUVECs。定期觀察細胞狀態(tài)，待細胞生長融合度達90%以上時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按1∶3比例傳代。收集長勢良好的第3代對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度，以每孔105個細胞接種至96孔板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)過夜。次日，以濃度為10-7mol/L AngⅡ分別刺激0、12、24和48 h。

1.3細胞分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的HUVECs，以每孔105個細胞接種至6孔板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h。次日，將細胞隨機分為對照組、陰性組和干擾組三組，每組重復(fù)3次。按照Lipofectamine2000說明書步驟將PTX3 siRNA和陰性對照序列轉(zhuǎn)染至干擾組和陰性組細胞中，其中PTX3 siRNA和陰性對照序列的終濃度為100 nmol/L，而對照組細胞不做轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換液，加入終濃度為10-7mol/L AngⅡ刺激48 h后，收集各組細胞。

1.4Western印跡檢測 采用總蛋白提取試劑盒提取HUVECs中的總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對所提取總蛋白進行定量。取蛋白樣品60 μg，加入等體積上樣緩沖液，混勻后沸水浴煮沸5 min。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜。 取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入封閉液中常溫反應(yīng)2 h。加入1∶1 000倍稀釋的PTX3特異性一抗4℃孵育過夜，再加入1∶10 000倍稀釋的二抗(含5%脫脂牛奶)37℃孵育1 h。暗室內(nèi)加入ECL試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity one軟件分析PTX3蛋白的表達量，以β-actin作為內(nèi)參校正。

1.5MTT檢測 取96孔細胞板，以每孔105個細胞接種至96孔板上，將細胞隨機分為空白組(未做任何處理)、 AngⅡ組(10-7mol/L AngⅡ刺激)、 AngⅡ+siNC組(轉(zhuǎn)染陰性對照序列后，給予10-7mol/L AngⅡ刺激)和 AngⅡ+siPTX3組(轉(zhuǎn)染PTX3 siRNA后，10-7mol/L AngⅡ刺激)，參照1.3中的方法轉(zhuǎn)染各組細胞后，并給予10-7mol/L AngⅡ刺激。其中，每組細胞設(shè)置5個復(fù)孔。分別刺激24、48和72 h后，收集細胞，加入MTT溶液(濃度0.5 mg/ml)20 μl孵育4 h后，以二甲基亞砜100 μl震蕩反應(yīng)10 min。選取570 nm波長，酶標儀檢測各組細胞的吸光度值(OD)。每組實驗重復(fù)3次。

1.6流式細胞儀檢測 收集空白組、 AngⅡ組、AngⅡ+siNC組和AngⅡ+siPTX3組細胞，以胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度，制備濃度為106個/ml的細胞懸液。取細胞懸液1 ml，以磷酸鹽緩沖液洗滌后，先加入結(jié)合緩沖液200 μl，再分別加入Annexin-V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)各5 μl，避光條件下充分反應(yīng)后，補加300 μl結(jié)合緩沖液。采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

1.7實對聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 收集空白組、AngⅡ組、AngⅡ+siNC組和AngⅡ+siPTX3組細胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并經(jīng)紫外分光光度計對總RNA進行定量。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以上海生工生物公司合成的ET-1引物(上游：5′-TCTGCCACCTGGACAT-3′,下游5′-CAGCCCTGAGTTCTTTT-3′)、iNOS引物(上游：5′-GGAAGCGGTAACAAAGGA-3′,下游5′-GCCAGCATAGCGGATG-3′)和β-actin引物(上游：5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′,下游5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′)進行PCR擴增。擴增條件：95℃預(yù)變性3 min(1 個循環(huán))，95℃變性 30 s(35 個循環(huán))，59℃退火 30 s(35個循環(huán))，72℃延伸1 min(35 個循環(huán))，72℃ 總延伸5 min(1 個循環(huán))。以β-actin為內(nèi)參，利用2-△△Ct法計算ET-1和iNOS mRNA表達。

1.8數(shù)據(jù)處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1AngⅡ刺激后各時間點HUVECs中PTX3的表達升高 與0 h(0.12±0.01)相比，12、24和48 h作用時間下PTX3蛋白表達(0.16±0.02、0.25±0.02、0.37±0.05)均明顯升高(P<0.05)，且在48 h作用時間下升高最明顯。見圖1。

2.2PTX3 siRNA下調(diào)HUVECs中PTX3的表達 與對照組(0.25±0.03)相比，陰性組細胞中PTX3 蛋白的相對表達量(0.22±0.02)無明顯變化(P>0.05)，但干擾組中PTX3 蛋白表達(0.10±0.01)明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 AngⅡ刺激后不同時間HUVECs中PTX3表達

圖2 PTX3 siRNA對HUVECs中PTX3表達的影響

2.3下調(diào)PTX3表達促進HUVECs增殖 相同作用時間下，與空白組相比，AngⅡ組、 AngⅡ+siNC組和AngⅡ+siPTX3組刺激不同時間細胞的OD值均明顯降低(P<0.05)，且AngⅡ+siPTX3組的下降幅度明顯小于 AngⅡ組(P<0.05)，而 AngⅡ+siNC組與AngⅡ組差異不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組刺激不同時間細胞的OD值

與空白組相比：1)P<0.05；與Ang Ⅱ組相比：2)P<0.05；下表同

2.4下調(diào)PTX3表達抑制HUVECs凋亡 與空白組(6.72%±2.26%)相比，AngⅡ組、 AngⅡ+siNC組和AngⅡ+siPTX3組細胞的凋亡率(23.35%±2.06%、22.85%±3.12%、13.31%±1.08%)均顯著升高(P<0.05)；同時，AngⅡ+siNC組與AngⅡ組細胞凋亡率無明顯改變，而AngⅡ+siPTX3組較AngⅡ組顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測結(jié)果

2.5下調(diào)PTX3表達抑制HUVECs中ET-1和iNOS mRNA表達 與空白組相比，AngⅡ組、 AngⅡ+siNC組和AngⅡ+siPTX3組細胞中ET-1和iNOS mRNA表達水平均明顯升高；與AngⅡ組相比，AngⅡ+siNC組細胞中ET-1和iNOS mRNA表達差異不顯著(P>0.05)，但AngⅡ+siPTX3組細胞中ET-1和iNOS mRNA表達明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞ET-1和iNOS mRNA相對表達量

3 討 論

作為一種體態(tài)識別分子，PTX3可被內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和樹突細胞等多種細胞在炎癥因子如脂多糖、腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β等刺激下產(chǎn)生，因其可識別多種配體，在先天免疫、組織修復(fù)和癌癥等方面均發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔10,11〕。PTX3在多種疾病組織或細胞中異常高表達，與多種細胞生理病理過程密切相關(guān)，被作為急性胰腺炎、膿毒癥和肺癌等疾病的生物標志物或診斷指標〔12～14〕。

研究〔15,16〕報道，沉默PTX3表達可通過抑制巨噬細胞趨化遷移改善胃癌相關(guān)的炎癥，而PTX3過表達則使食管癌細胞增殖和集落形成減少，凋亡率增加，改善腫瘤的發(fā)展。在炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡過程中常常伴隨有PTX3基因表達升高〔17〕。張旦歡等〔18〕在高脂血癥小鼠中尾靜脈注射PTX3抗體后，可通過抑制核因子(NF)-κB通路下調(diào)血脂水平，減緩了動脈粥樣硬化進展。有報道〔19〕指出，在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的平滑肌細胞中PTX3表達升高，細胞增殖和遷移能力增強，PTX3參與了動脈粥樣硬化的形成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTX3表達呈時間依賴性升高。Qiu等〔20〕發(fā)現(xiàn)，厚樸酚通過抑制PTX3表達改善棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能失調(diào)的結(jié)果與本文吻合。提示，PTX3可能在動脈粥樣硬化進展中發(fā)揮促進作用。

內(nèi)皮細胞還可通過釋放血管活性物質(zhì)如一氧化氮(NO)和ET-1等調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的功能。NO是由NO合酶(NOS)催化左旋精氨酸(L-Arg)氧化生成，在血管擴張、抑制血小板凝聚和血管平滑肌細胞的生長過程中發(fā)揮著重要作用；iNOS是NOS的一種異結(jié)構(gòu)，iNOS激活可誘導(dǎo)高濃度NO合成，進而加重細胞損傷。ET-1則與NO作用相反，可以引起血管收縮，激活巨噬細胞，促進血管平滑肌細胞增殖和遷移，在動脈粥樣硬化中發(fā)揮促進作用。Iba等〔21〕在慢性腎臟病患者內(nèi)皮功能障礙的研究中發(fā)現(xiàn)，PTX3與ET呈正相關(guān)。Zhao等〔22〕指出，PTX3可通過介導(dǎo)的iNOS表達和Iκb激酶(IKK)/IκB/NF-κB活化加重動脈粥樣硬化誘導(dǎo)的HUVEC損傷。提示，PTX3可能通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞分泌NO和ET-1參與動脈粥樣硬化。

綜上，PTX3在AngⅡ刺激后HUVECs中表達升高，下調(diào)其表達可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細胞凋亡及血管活性物質(zhì)分泌。PTX3有望成為防治動脈粥樣硬化的靶標。