邵帥 洪樂鵬 鄧雪華 江梅 丁濤 姜經(jīng)航 王開秀

(1荊門市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學科，湖北 荊門 448000；2廣州醫(yī)科大學人體解剖教研室;3韶關(guān)學院醫(yī)學院人體解剖教研室)

研究顯示，帕金森病(PD)模型中有磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt)信號通路的抑制〔1～7〕，說明該通路參與PD發(fā)病的相關(guān)進程，而PD的神經(jīng)保護類藥物也是通過PI3K/AKt信號通路來發(fā)揮神經(jīng)保護作用的，如：在6-羥基多巴誘導的PD模型中，人堿性成纖維細胞生長因子通過PI3K/AKt信號通路來抑制Tau蛋白磷酸化〔8〕；來自金銀花的提取物類黃酮也可以通過PI3K/AKt信號通路來抑制小鼠小膠質(zhì)瘤細胞(BV2)誘導的炎癥反應(yīng)〔9〕。盡管PI3K/AKt信號通路在PD的發(fā)病及神經(jīng)保護作用中扮演重要角色，但目前尚無研究報道關(guān)于抑制PI3K/AKt信號通路對PD炎癥反應(yīng)的影響。本文觀察抑制PI3K/AKt信號通路對PD炎癥反應(yīng)表達的影響。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 BV2細胞株為南方醫(yī)科大學人體解剖學教研室惠贈。DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國GIBCO公司；脂多糖(LPS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體購自美國Sigma公司；LY294002(LY)購自美國Santa Cruz公司；電化學發(fā)光(ECL)液購自賽默飛公司；磷酸化(p)-AKt、AKt抗體購自Abcam公司；β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標記-山羊抗兔為中杉金橋生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；Trizol 購自美國invitrogen 公司。RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、RNase-free H2O均購自TakaRa公司。

1.2方法

1.2.1BV2細胞培養(yǎng) BV2細胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基+10%FBS+1%青鏈霉素，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h換液。

1.2.2細胞處理及分組 BV2細胞消化傳代以1×105/ml接種于6孔板中并加入2 ml完全培養(yǎng)基，24 h后換液并處理細胞，細胞共分為4組：(1)對照組：相同的時間加入等量的生理鹽水；(2)LPS組：1 μg/ml LPS孵育24 h；(3)LY+LPS組：20 μmol/L LY處理0.5 h后，1 μg/ml LPS孵育24 h；(4)LY組：20 μmol/L LY處理。

1.2.3Western印跡檢測 細胞經(jīng)上述藥物處理后，加入RIPA 裂解液〔含1%的苯甲基磺酰氟(PMSF)〕提取蛋白，酶標儀檢測蛋白濃度?？偟鞍着c上樣緩沖液進行加熱變性，用40 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉(SDS)/聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，然后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉，一抗p-AKt、AKt、iNOS、β-actin各1∶1 000稀釋孵育，4℃過夜，二抗1∶1 000 室溫孵育2 h，化學發(fā)光顯影。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測

1.2.4.1引物設(shè)計 根據(jù)Primer-BLAST 的cDNA 序列，分別設(shè)計β-actin、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α引物序號。β-actin正義鏈5′-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3′，反義鏈5′-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-3′；IL-1β正義鏈5′-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′，反義鏈5′-GGAAGGTCCACGGGAAAGAC-3′；TNF-α正義鏈5′-ATGGCCTCCCTCTCATCAGT-3′，反義鏈5′-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3′。

1.2.4.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 細胞經(jīng)藥物處理后，用Trizol 法提取細胞總RNA。在NanoDrop-1000分光光度計上檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的降解度，將各組的RNA通過RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，添加上表中相關(guān)引物擴增各基因。ABI 7500軟件檢測各基因的mRNA表達水平。熒光定量PCR擴增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每組均重復3次實驗。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析進行比較。

2 結(jié) 果

2.1LPS處理后對PI3K/AKt信號通路的影響 LPS組p-AKt/AKt蛋白比明顯下調(diào)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；LY+LPS組p-AKt/AKt蛋白比顯著低于LPS組(P<0.01)。LY組p-AKt/AKt蛋白比顯著高于LY+LPS組(P<0.01)。各組AKt蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

2.2抑制PI3K/AKt信號通路對炎癥因子表達的影響 LPS組IL-1β、TNF-α mRNA表達水平明顯高于對照組(均P<0.01)；LY+LPS組IL-1β、TNF-α mRNA表達顯著低于LPS組(均P<0.01)；LY組IL-1β、TNF-α mRNA表達水平明顯低于LY+LPS組(均P<0.01)。見表1。

圖1 Western印跡檢測各組p-AKt、AKt蛋白表達

2.3抑制PI3K/AKt信號通路對iNOS表達的影響 LPS組iNOS蛋白表達顯著高于對照組(P<0.01)；LY+LPS組iNOS蛋白表達顯著低于LPS組(P<0.01)。LY組iNOS蛋白表達顯著低于LY+LPS組(P<0.01)。見圖2，表1。

圖2 Western印跡檢測各組iNOS蛋白表達

表1 各組p-AKt/AKt、AKt、iNOS蛋白及IL-1β 、TNF-α mRNA表達水平比較

與對照組比較：1)P<0.01；與LPS組比較：2)P<0.01；與LY+LPS組比較：3)P<0.01

3 討 論

PD是除了阿爾茨海默病外的第二大神經(jīng)退行性疾病，多見于中老年人，但近年隨著環(huán)境惡化，PD也逐漸年輕化。調(diào)查顯示65歲以上PD患病率為1%，85歲以上PD患病率為5%〔10〕。目前尚無有效治療PD的方法，針對PD癥狀治療的藥物也無法干預PD的進程，因此從PD的發(fā)病機制尋找治療方法勢在必行，小膠質(zhì)細胞參與的神經(jīng)炎癥導致的多巴胺能神經(jīng)元死亡在PD發(fā)病及其進程中發(fā)揮重要作用〔11〕。

PI3K/AKt信號通路除調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、代謝、抗細胞凋亡等細胞生物學作用外，還能調(diào)節(jié)學習記憶能力。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKt信號通路與PD的聯(lián)系越來越緊密，PI3K/AKt信號在PD中存在通路抑制，而且神經(jīng)保護藥物也是通過該通路發(fā)揮作用，如：E3泛素連接酶c-Cb1抑制小膠質(zhì)細胞介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與PI3K/AKt信號通路有關(guān)〔12〕，法舒地爾在PD模型內(nèi)也是通過PI3K/AKt信號通路依賴的方式來抑制炎癥，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔13〕?？梢圆孪雴为毤せ頟I3K/AKt信號通路也可以發(fā)揮一定抑炎及神經(jīng)保護作用。

本研究中LPS刺激BV2細胞后產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時出現(xiàn)PI3K/AKt信號通路的抑制，這與Dilshara等〔14〕的研究結(jié)果相一致。LY預處理抑制PI3K/AKt信號通路后則明顯抑制LPS誘導的炎癥反應(yīng)，降低IL-1β、TNF-α mRNA表達水平；單獨使用LY預處理抑制PI3K/AKt信號后則出現(xiàn)更為明顯的炎癥抑制效果；iNOS既作為促炎因子又作為氧化應(yīng)激分子，在PD發(fā)病機制及加速神經(jīng)死亡中發(fā)揮重要作用，LY預處理抑制PI3K/AKt信號通路后，不管是炎性反應(yīng)激活中的iNOS蛋白，還是正常細胞中的iNOS蛋白表達均被明顯抑制。單從文獻報道的神經(jīng)保護類藥物可以通過PI3K/AKt信號通路來發(fā)揮對PD的神經(jīng)保護作用來看，激活PI3K/AKt信號通路后應(yīng)該會對PD起一定的有利作用，而本研究結(jié)果剛好與預想結(jié)果相矛盾，炎癥反應(yīng)中PI3K/AKt信號通路與PD的作用需進一步深入研究，也有可能與細胞的不同，藥物預處理時間不同等有關(guān)。

綜上所述，炎癥反應(yīng)中有PI3K/AKt信號通路的抑制，LY抑制PI3K/AKt信號通路后，可以明顯抑制促炎因子的表達，具體的抑炎有待進一步研究查證，這為從炎性反應(yīng)方向和PI3K/AKt信號通路研究PD提供了新的思考，為PD的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。