黃玉圣 呂辰菲 莊景燊 徐平 涂晨 吳迪崢 鐘招明

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 1脊柱骨科，廣東 廣州 510515；2神經(jīng)內(nèi)科)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和組織器官中，如骨、軟骨、脂肪、內(nèi)皮、肌肉和神經(jīng)組織等，以骨髓組織中含量最為豐富，占骨髓細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.100%〔1〕。骨髓MSCs(BMSCs)具有自我復(fù)制能力和向成骨、成脂、成軟骨等多向分化能力，可參與骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，維持組織和器官的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及修復(fù)組織損傷等方面。衰老是生物界的普遍現(xiàn)象，BMSCs也可發(fā)生衰老變化。衰老的BMSCs不但形態(tài)上會(huì)發(fā)生變化，其增殖和多向分化能力也會(huì)發(fā)生不同程度的改變〔2〕。BMSCs的體外培養(yǎng)是其功能研究的重要途徑。有研究表明體外培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而衰老，甚至喪失其特有的功能〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，探討傳代次數(shù)對(duì)BMSCs衰老的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4周齡的SD雄性大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2016-0041，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要試劑與器械 胎牛血清(FBS，Sigma)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher 公司)，青-鏈霉素(PanEra Life Science)，0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA，PanEra LifeScience)，MEM/F12(Hyclone公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，水平離心機(jī)(上海德洋意邦儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)(廣州瑞智科學(xué)儀器有限公司)，SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(MDS公司)，倒置顯微鏡(德國(guó)Leica儀器股份有限公司，DM IL LED),電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-RAD),化學(xué)發(fā)光儀(Tanon),細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(Beyotime),CCK-8試劑盒(Beyotime),兔抗大鼠單克隆抗體P53、P21(Abcam),大鼠Ig G二抗(Proteintech)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1SD大鼠BMSCs的原代分離與培養(yǎng) 3～4周齡SD雄性大鼠脫頸處死，體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡 5 min，無(wú)菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，浸泡于裝有75%酒精的10 ml離心管中，帶入超凈臺(tái)中，用高溫消毒后的器械剔除肌肉和貼附骨面的纖維結(jié)締組織，剪開(kāi)股骨和脛骨的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5 ml無(wú)菌注射器抽取PBS(含青-鏈霉素100 U/ml)，反復(fù)柔沖骨髓腔 3～5次,直至骨髓腔呈白色。70 mm篩網(wǎng)過(guò)濾后，收集過(guò)濾液以800 r/min離心3 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻，冰上裂解3 min后，800 r/min 離心3 min，棄上清，按1×109/ml密度接種至100 mm的培養(yǎng)皿，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2BMSCs 的純化與擴(kuò)增 原代培養(yǎng)48 h半量換液，72 h后全量換液，全量更換培養(yǎng)基(不沖洗)，可將其中未貼壁細(xì)胞去除，以后每3 d全量更換新鮮培養(yǎng)基，PBS沖洗兩遍。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底，密度達(dá)80%融合時(shí)，用0.02%EDTA+ 0.25%胰酶消化，消化時(shí)間約2 min,加入全培終止消化，800 r/min 離心3 min，棄上清，用含10%胎牛血清的 MEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟進(jìn)行 P2～9代的傳代培養(yǎng)。

1.3.3BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察 取各代細(xì)胞，每日用倒置相差顯微鏡觀察其生長(zhǎng)形態(tài)及特征并拍照記錄。

1.3.4BMSCs表面標(biāo)志物的鑒定 取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞于5 ml離心管中，800 r/min離心3 min，除上清，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/L，取流式細(xì)胞儀專用試管4個(gè)，每管加入300 μl細(xì)胞懸液，加入熒光抗體CD29 FITC、CD45 PE-Cy5.5、CD90 PE及同型對(duì)照抗體各5 μl，孵育15 min，采用BDFACSEALIBUR流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5BMSCs 細(xì)胞周期檢測(cè) 取生長(zhǎng)良好的P3 BMSCs，先收集培養(yǎng)液備用，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，洗下的細(xì)胞也需收集，胰酶消化，加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，以800 r/min離心 3 min富集細(xì)胞，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞一次(2 000 r/min,5 min),收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml,取1 ml細(xì)胞懸液，以800 r/min離心3 min富集細(xì)胞，棄上清，在細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μl重懸，吹勻細(xì)胞，4℃過(guò)夜。次日離心收集細(xì)胞，再以1 ml PBS洗滌1次，除去固定液，1 000 r/min離心3 min，加入100 μl RNase A,37℃水浴30 min,再加入400 μl碘化丙啶(PI)，4℃避光孵育30 min，離心棄上清，200 μl PBS 重懸后,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3.6BMSCs生長(zhǎng)曲線的繪制 取P1、P3、P5、P7和P9代細(xì)胞，胰酶消化重懸后計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，分為8組，每組6個(gè)復(fù)孔，于第1～7天同一時(shí)間作相同檢測(cè)，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。以時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.7細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色 細(xì)胞傳代，分別取P1、P3、P5、P7和P9代細(xì)胞，PBS洗3次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min,PBS洗3次，加上新配制的SA-β-gal 染色工作液，保鮮膜封口，37℃(無(wú)CO2)孵育過(guò)夜，PBS液清洗3次后，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.8免疫印跡檢測(cè) 加入RIPA 細(xì)胞裂解液靜置5 min，超聲破碎儀裂解1 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，條帶加入兔抗大鼠P53和P21單克隆抗體(1∶1 000)，選取37 kD GAPDH作為內(nèi)參，4℃ 20 r/min孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min x 3次，加入 HRP 標(biāo)記的大鼠IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，化學(xué)發(fā)光，采用Image J計(jì)算目標(biāo)各帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SD大鼠BMSCs鑒定 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示，培養(yǎng)的P3 BMSCs均一表達(dá)CD29及CD90，陽(yáng)性率分別為97.72%，98.23%;而CD45，呈陰性，陽(yáng)性率為1.52%。

2.2BMSCs 細(xì)胞周期 流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3 BMSCs細(xì)胞周期，細(xì)胞100%為二倍體，其中G0/G1期87.37%，G2/M期4.06%，S期8.57%，提示絕大部分細(xì)胞處于靜止休眠期，符合干細(xì)胞周期特征。

2.3不同代數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 分別對(duì)P1、P3、P5、P7和P9代細(xì)胞進(jìn)行1～7 d連續(xù)培養(yǎng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，傳代后1～2 d處于潛伏期，細(xì)胞增長(zhǎng)不明顯，3～5 d進(jìn)入指數(shù)増長(zhǎng)期，6 d后細(xì)胞增殖速度便有所減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，增殖基本停滯，生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。從結(jié)果可發(fā)現(xiàn)P3～P5代的細(xì)胞增殖狀況更良好。

圖1 CCK-8檢測(cè)不同代數(shù)BMSCs 1～7 d的增殖能力

2.4不同代數(shù)細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率 對(duì)不同代數(shù)的細(xì)胞行β-半乳糖苷酶染色，紅色箭頭標(biāo)注的著深藍(lán)色的細(xì)胞即為衰老細(xì)胞(圖2)。隨之進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，其中P7(52.67%±7.93%)和P9(83.67%±3.27%)相較于P1(3.67%±1.25%)、P3(8.33%±3.11%)和P5(20.00%±5.35%)，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增高(圖2)。

2.5不同代數(shù)細(xì)胞P53和P21表達(dá)變化 隨著傳代次數(shù)的增加，衰老相關(guān)蛋白P53和P21的蛋白水平表達(dá)量也逐漸增高，Western印跡結(jié)果示：P53和P21在P9代的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.43±0.66和3.31±0.28，明顯高于P1代，見(jiàn)圖3，表1。

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞(×100)

圖3 細(xì)胞傳代對(duì)衰老相關(guān)蛋白P53和P21表達(dá)的影響

組別P53蛋白P21蛋白P11.00±0.001.00±0.00P31.60±0.111.15±0.07P52.41±0.361.81±0.18P72.86±0.902.79±0.04P93.43±0.661)3.31±0.281)

與P1代比較:1)P<0.05

3 討 論

BMSCs是骨髓基質(zhì)中的非造血系成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。雖然BMSCs 沒(méi)有公認(rèn)的獨(dú)特的抗原表型，但其培養(yǎng)過(guò)程可表達(dá)細(xì)胞CD表型〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的BMSCs 均一表達(dá)CD29,CD90，陽(yáng)性率分別為97.72%，98.23%，均大于95.00%;而CD45，呈陰性，陽(yáng)性率為1.52%，小于5.00%，符合文獻(xiàn)報(bào)道MSCs表面抗原的表達(dá)〔7〕。前期研究表明干細(xì)胞大部分細(xì)胞處于靜止休眠期，此實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)G0/G1期占88.37%，符合干細(xì)胞周期特征。

骨髓細(xì)胞成分復(fù)雜，造血干細(xì)胞是骨髓中含量最豐富的細(xì)胞，而MSCs 僅占骨髓細(xì)胞的 0.001%～0.01%〔8〕。由于BMSCs在骨髓中豐度低、分選難、分離細(xì)胞活性弱、純度低、生物學(xué)活性易改變等缺點(diǎn),嚴(yán)重限制了BMSCs的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法體外培養(yǎng)BMSCs，具有操作簡(jiǎn)便、效果可靠、對(duì)細(xì)胞活性影響較小等優(yōu)點(diǎn)〔9,10〕。

細(xì)胞增殖能力下降是機(jī)體衰老的重要影響因素。既往研究發(fā)現(xiàn)，年輕小鼠中獲取的MSCs的數(shù)量、細(xì)胞增殖能力明顯優(yōu)于老齡小鼠MSCs〔11,12〕。MSCs發(fā)生衰老時(shí)，影響其分化潛能，成脂能力增加而成骨分化能力下降〔13～15〕。本研究證實(shí)隨著體外細(xì)胞傳代次數(shù)增加，可導(dǎo)致MSCs增殖能力的改變，從而發(fā)生復(fù)制性衰老。

體外培養(yǎng)細(xì)胞在pH為6時(shí)，其β-半乳糖苷酶染色的陽(yáng)性率隨代齡增加而增加，這種中性β-半乳糖苷酶被定義為衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶。衰老細(xì)胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X-Gal,生成深藍(lán)色產(chǎn)物,被作為衰老細(xì)胞的生物標(biāo)記〔16,17〕。研究表明衰老BMSCs細(xì)胞核膜內(nèi)折，核染色質(zhì)濃縮，線粒體數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，體積增大或腫脹，并且高度表達(dá)β-半乳糖苷酶〔18〕。本研究證實(shí)隨著體外細(xì)胞傳代次數(shù)增加，β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率細(xì)胞增加。

細(xì)胞衰老與基因調(diào)控密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)具有細(xì)胞增殖調(diào)控功能的衰老相關(guān)基因包括抑癌基因P53、P21和P16、細(xì)胞周期素D1、周期素依賴性激酶(CDK)2、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、轉(zhuǎn)錄因子(E2F)等，這些基因在調(diào)控細(xì)胞衰老的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，隨著傳代次數(shù)的增加，BMSCs表達(dá)衰老相關(guān)蛋白P53和P21增加，蛋白表達(dá)量明顯高于低傳代次數(shù)BMSCs。綜上所述，體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增加，BMSCs增殖能力明顯下降，衰老細(xì)胞數(shù)量增加。為了避免復(fù)制性衰老對(duì)BMSCs功能研究的影響，建議使用P1-5代細(xì)胞。此外，深入研究BMSCs衰老的調(diào)控機(jī)制和作用靶點(diǎn)，可為延緩干細(xì)胞衰老及防治各種老齡化疾病提供重要的理論基礎(chǔ)。