張 靜，陳文生，胡曉曦，黃 瓊，吳育晶，魏 偉

免疫球蛋白D(immunoglobulin D, IgD)作為一類免疫球蛋白，主要以膜結(jié)合形式作為B細胞受體發(fā)揮作用，也可少量以分泌形式作為抗體發(fā)揮作用[1]。病理狀態(tài)下IgD與T細胞上IgD受體(IgDR)的過度結(jié)合，可能導(dǎo)致自身抗體生成增多，自身免疫反應(yīng)增強，從而介導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生[2]。IgD在一些類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者中高水平表達[3]。因此，以IgD-IgDR為治療靶點研發(fā)針對治療高水平IgD的自身免疫性疾病的新型生物制劑具有較好的臨床前景。該實驗首次制備出重組人IgD-Fc片段蛋白，并檢測重組人IgD-Fc片段蛋白在健康人CD4+T細胞上與IgDR結(jié)合的親和力大小，起到與IgD競爭IgDR的作用，為進一步研發(fā)針對高水平IgD自身免疫性疾病的新型生物制劑奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集安徽醫(yī)科大學(xué)健康志愿者外周血標本共20例，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準，受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器人IgD蛋白(美國Abcam公司)；Jurkat、MOLT-4細胞株(中國科學(xué)院上海細胞庫)；胎牛血清(美國Gibco公司)；紅細胞裂解液(美國BD公司)；TRIzol 試劑(美國Invitrogen公司)；人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品有限公司)；CD4+T細胞免疫分選磁珠(德國美天妮試劑公司)；His-Tag親和層析柱(美國GE公司)；10 ku蛋白超濾管(美國Millipore公司)；瓊脂糖膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；IPTG(美國Sigma公司)；超聲細胞破碎儀(南京賽飛生物科技有限公司)；恒溫搖菌箱(美國Thermo公司)；蛋白純化儀(美國GE公司)；FC500流式細胞儀(美國Beckman Coulter 公司)。

1.3 方法

1.3.1pET28a(+)/IgD-Fc表達載體的構(gòu)建

1.3.1.1健康人外周血cDNA獲取 向1 ml血液中加入3 ml紅細胞裂解液，室溫放置10 min后10 000 r/min離心1 min；棄上清液，加入1 ml TRIzol試劑混勻，室溫放置5 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入0.2 ml氯仿，振蕩15 s后冰上放置3 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取水相，加入等體積冰冷異丙醇，冰上放置20 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 ml 75%乙醇，4 ℃、10 000 r/min離心2 min，棄上清液；室溫干燥10 min，加入20 μl DEPC水，溶解RNA；將RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 保存在-20 ℃待用。

1.3.1.2IgD-Fc基因片段的擴增及重組表達載體的構(gòu)建 設(shè)計上游引物：5′-GCTAGCATGTGTCCGAGCC-3′，下游引物：5′-TCTGAGCTAGTTGAGCAGAGTCCG-3′，以上步cDNA為模板，擴增條件為94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行電泳檢測并回收純化目的片段。將IgD-Fc PCR產(chǎn)物與pGMT-easy克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后均勻涂布于含氨芐霉素的培養(yǎng)板，挑取單克隆菌落，37 ℃搖菌培養(yǎng)12 h后堿裂解法抽提質(zhì)粒。IgD-Fc pGMT- easy克隆載體雙酶切，pET28a(+)表達載體雙酶切，凝膠電泳分離并回收酶切產(chǎn)物，將雙酶切后的目的片段連接于pET28a(+)表達載體，轉(zhuǎn)化至DH5a，提取質(zhì)粒，進行IgD-Fc表達載體酶切初步驗證和測序鑒定。

1.3.2重組人IgD-Fc片段蛋白的誘導(dǎo)表達 將pET28a(+)/IgD-Fc原核表達載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單菌落于含卡那霉素的LB培基中，150 r/min擴大培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6時加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)表達6 h。

1.3.3重組人IgD-Fc片段蛋白的親和層析、分子篩純化及產(chǎn)物測定 向離心后的菌液沉淀中加入適量裂菌液(NaH2PO4·2H2O 20 mmol/L，NaCl 500 mmol/L，甘油10%，Triton X-100 1%，PMSF 1 mmol/L，溶菌酶1 mg/ml)并重懸，冰上裂解30 min后冰浴超聲破碎15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液留存，SDS-PAGE分析IgD-Fc重組蛋白表達形式。采用His-Tag預(yù)裝柱純化IgD-Fc重組蛋白，收集洗脫產(chǎn)物后采用10 ku蛋白超濾管進行二次純化。將蛋白產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色，通過掃描灰度值分析IgD-Fc重組蛋白純度。

1.3.4CD4+T細胞的分離、T淋巴瘤細胞株的培養(yǎng) 密度梯度離心法分離血液中單個核細胞，每107細胞加50 μl CD4+磁珠，混合均勻，30 ℃孵育30 min；加入1 ml BD清洗Buffer混勻后放至磁力架上孵育10 min；吸棄流式管內(nèi)上清液，加入1 ml BD清洗Buffer，孵育5 min，并重復(fù)操作；重懸陽性成分，轉(zhuǎn)入含5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中用于實驗。T淋巴瘤細胞株采用含10%胎牛血清的RPMI-1640、37 ℃、5% CO2進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.5外周血CD4+T細胞和T淋巴瘤細胞株表面IgDR的表達 利用FITC熒光標記試劑盒標記人IgD蛋白(FITC-IgD)，具體操作參見說明書，向CD4+T細胞及Jurkat、MOLT-4細胞株中加入不同濃度的FITC-IgD，共同37 ℃孵育1 h，并設(shè)置空白對照組，PBS洗滌后適量重懸細胞，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.3.6IgD與CD4+T細胞和T淋巴瘤細胞株表面IgDR的親和力實驗 將CD4+T細胞和Jurkat、MOLT-4細胞以2×106/孔的密度接種至6孔板，加入不同濃度FITC-IgD，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌后適量重懸細胞，上機檢測熒光強度。各濃度組的熒光強度減去空白對照組熒光強度，得到各濃度組IgD的特異性結(jié)合量，分別以不同濃度FITC-IgD為X軸，特異性結(jié)合量為Y軸，繪制飽和曲線，計算最大結(jié)合量(Bmax)和解離常數(shù)(KD)[4]。

1.3.7CD4+T細胞的IgDR競爭結(jié)合實驗 CD4+T細胞以2×106/孔的細胞密度鋪6孔板，分別加入FITC-IgD(10 μg/ml)和不同濃度的重組人IgD-Fc片段蛋白(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μg/ml)，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌后適量重懸細胞，上機檢測熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 重組人IgD-Fc片段蛋白的表達、純化

2.1.1pET28a(+)/IgD-Fc原核表達載體構(gòu)建 通過PCR法擴增目的基因，連接克隆載體，雙酶切，連接表達載體。經(jīng)凝膠電泳檢測(圖1)、測序鑒定(圖2)，序列正確，成功構(gòu)建原核表達載體pET28a(+)/IgD-Fc。

2.1.2重組人IgD-Fc片段蛋白的表達 誘導(dǎo)后的上清在34 ku附近有一條明顯的條帶(圖3)，與理論值相符。而未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的BL21(DE3)野生菌株在34 ku附近無明顯條帶。表明重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達成功，且以可溶性蛋白形式存在。

2.1.3重組人IgD-Fc片段蛋白的純化 通過His-Tag親和層析和分子篩層析兩步純化，得到純度95%以上的重組人IgD-Fc片段蛋白(圖4、5)。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a(+)/IgD-Fc雙酶切鑒定

M：DNA Marker；1：空載體pET-28a(+)；2：重組質(zhì)粒pET28a(+)/IgD-Fc；3、4：經(jīng)雙酶切處理后的重組質(zhì)粒pET28a(+)/IgD-Fc

2.2 CD4+T細胞和T淋巴瘤細胞株表面IgDR的表達FITC-IgD與IgDR結(jié)合后，流式細胞儀檢測細胞表面FITC熒光強度。結(jié)果顯示：隨FITC-IgD濃度增高，流式峰圖顯著右移，證明CD4+T細胞(圖6)、Jurkat和MOLT-4細胞(圖7、8)上均有IgDR表達。

2.3 IgD與CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面IgDR的親和力不同濃度FITC-IgD與細胞共同孵育后流式細胞儀檢測FITC熒光強度，結(jié)果顯示隨FITC-IgD濃度增加，結(jié)合到IgDR上的配體逐漸增多，結(jié)合到IgDR的IgD可通過流式細胞儀檢測其FITC平均熒光強度(MFI)并繪制飽和曲線(圖9)，分別計算IgD與CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面IgDR結(jié)合的Bmax和KD。結(jié)果顯示, CD4+T細胞(Bmax=4 502±144.6,KD=7.254±0.956 7,R2=0.975 1)、Jurkat(Bmax=2 722±112.7, KD=9.876±1.589,R2=0.963 2)、MOLT-4細胞(Bmax=2 751±100.2, KD=7.88±1.161,R2=0.968 9)表面IgDR與IgD親和力相近。

圖2 原核表達載體pET28a(+)/IgD-Fc測序圖

圖3 IgD-Fc重組蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測

M：蛋白Marker；1、2、3：大腸桿菌BL21(DE3)總蛋白；4、5、6：轉(zhuǎn)化pET28a(+)/IgD-Fc的BL21(DE3)總蛋白

圖4 重組人IgD-Fc片段蛋白His-Tag親和層析純化峰圖

圖5 重組人IgD-Fc片段蛋白的純化

M：蛋白Marker；1、2：大腸桿菌BL21(DE3)總蛋白；3：親和層析純化產(chǎn)物；4：第二步純化流穿產(chǎn)物；5：分子篩層析產(chǎn)物

圖6 CD4+T細胞表面IgDR表達

圖7 Jurkat細胞表面IgDR表達

圖8 MOLT-4細胞表面IgDR表達

2.4 重組人IgD-Fc片段蛋白、IgD與CD4+T細胞表面IgDR的競爭結(jié)合實驗不同濃度重組人IgD-Fc片段蛋白與10 μg/ml FITC-IgD共同孵育CD4+T細胞，流式細胞儀檢測FITC熒光強度。結(jié)果顯示隨蛋白濃度增加，細胞表面FITC強度逐漸減弱，提示重組人IgD-Fc片段蛋白濃度依賴性地降低了IgD與IgDR的結(jié)合。根據(jù)FITC熒光強度的變化繪制重組人IgD-Fc片段蛋白針對IgD/IgDR結(jié)合的抑制曲線(圖10)，分別計算IC50值，結(jié)果顯示，重組人IgD-Fc片段蛋白(IC50=6.927, Log IC50=0.840 5±0.077 89,R2=0.893 4)可競爭性結(jié)合IgDR。

3 討論

人IgD是由兩條相同的輕鏈和重鏈組成具有Ig超家族特征的可變區(qū)(V)和恒定區(qū)(C)[5]，其Cδ3段由于部分脯氨酸殘基缺失以及N端兩個糖基化位點而區(qū)別于其他Ig，正是這種結(jié)構(gòu)導(dǎo)致IgD的特殊生物學(xué)特性[6]。IgD的兩個Fab片段主要位于Fc片段兩側(cè)，由于半延伸鉸鏈的靈活性，F(xiàn)ab可以圍繞Fc片段自由旋轉(zhuǎn)，因此能在較低濃度下促進抗原結(jié)合[7]。

圖9 IgD與CD4+ T細胞、Jurkat 細胞、MOLT-4細胞上IgDR結(jié)合的飽和曲線

圖10 CD4+T細胞上IgDR的競爭結(jié)合實驗

自身免疫性疾病是由于對自身抗原失去免疫耐受而引發(fā)的一種慢性疾病，表現(xiàn)為一種可能涉及宿主體內(nèi)多個器官的異質(zhì)性疾病群[8]。遺傳易感性和環(huán)境誘因使T細胞逃避中樞和外周耐受性，對自身抗原產(chǎn)生自激反應(yīng)，抵抗自身抗原的T細胞過度增殖而導(dǎo)致器官損傷[9]。臨床顯示，自身免疫性疾病患者血液中分泌型IgD(sIgD)水平較高，如：RA、SLE等[3]。Nguyen et al[10]研究認為，抗IgD抗體可以調(diào)節(jié)人固有和適應(yīng)性細胞因子反應(yīng)，以抗IgD為靶點可能在自身免疫性疾病治療中有一定的應(yīng)用價值。T細胞上IgDR交聯(lián)可以抑制T細胞凋亡，且IgDR能夠促進同源T細胞和初始B細胞間免疫突觸的形成，增加抗原呈遞和抗體產(chǎn)生。RA是一種炎癥自身免疫性疾病，抑制T細胞過度活化被認為是RA的潛在臨床治療方法[11]。研究[3,12]顯示，相比健康對照者，IgD水平及IgDR的表達在RA患者中更高，且IgD可誘導(dǎo)RA患者T細胞異?；罨gD也可促進健康人CD4+T細胞增殖與活化[13]和T淋巴瘤細胞株Jurkat、MOLT-4的異常增殖。以上結(jié)果提示在自身免疫性疾病中T細胞處于過度活化狀態(tài)，異常升高的IgD和IgDR水平可能在T細胞異常增殖與活化過程中扮演重要角色，而IgD-IgDR可能成為IgD水平升高的自身免疫性疾病治療的新靶點。

課題組在蛋白構(gòu)建過程中，嘗試了三種IgD片段的重組：① 全長IgD，由于全長IgD包含了IgD的功能域與結(jié)合域，故表現(xiàn)出與IgD相近的功能，未能起到阻斷IgD的促增殖作用；② IgD-Fc片段，去除了IgD的Fab段，仍未起到阻斷IgD功能的作用，提示IgD-Fc中包含了IgD的功能域及結(jié)合域；③ IgD重鏈CH2-CH3結(jié)構(gòu)域，成功阻斷了IgD的促增殖作用。綜上，經(jīng)蛋白活性篩選，確定了IgD-CH2-CH3重鏈結(jié)構(gòu)域才是有藥理活性的理想IgD片段。本實驗以IgD-IgDR為靶點，成功擴增出含人IgD重鏈CH2-CH3段結(jié)構(gòu)域的基因片段，構(gòu)建了含有該段基因的克隆及原核表達載體，并進行原核蛋白表達和層析純化，制備出重組人IgD-Fc片段蛋白。與分離天然來源和化學(xué)合成相比，在大腸桿菌中重組表達是一種更經(jīng)濟有效的大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的方法[14]。本實驗采用低誘導(dǎo)溫度(20 ℃)和低IPTG濃度(0.4 mmol/L)，通過減慢蛋白合成速率，增加蛋白正確折疊，為重組蛋白的正確表達提供了更有利的條件。pET 載體系統(tǒng)是一種能高效表達重組蛋白的載體蛋白，具有高度特異性和穩(wěn)定性，在外源基因的原核表達中具有廣泛的應(yīng)用價值。

本實驗檢測了CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株Jurkat和MOLT-4表面IgDR的表達情況，進行IgD與CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株Jurkat和MOLT-4表面IgDR的親和力比較，以及重組人IgD-Fc片段蛋白與CD4+T細胞表面IgDR的競爭結(jié)合比較。結(jié)果表明，CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面均有IgDR表達，CD4+T細胞及T淋巴瘤細胞株表面IgDR與IgD親和力相近，重組人IgD-Fc片段蛋白可以競爭性結(jié)合IgDR，濃度依賴性地降低IgD與IgDR的結(jié)合，阻斷IgD-IgDR通路，抑制IgD誘導(dǎo)的T細胞過度活化，為進一步研發(fā)針對高水平IgD的自身免疫性疾病的新型生物制劑奠定了實驗基礎(chǔ)。