王 瑤，倪明珠，劉文燦，宋莉莉，王兆平，王文靜

皮質(zhì)下缺血性血管性認(rèn)知障礙(subcortical ischemic vascular disease with cognitive impairment，SVCI)是血管性認(rèn)知障礙的主要亞型之一，是引起老年性認(rèn)知障礙的第二大原因[1]，因其較高的發(fā)病率和較好的均質(zhì)性[2]，一直以來被研究者廣泛關(guān)注。目前SVCI發(fā)病的遺傳機(jī)制仍不清楚。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因是熱門的癡呆備選基因之一，已有研究[3]證實(shí)，攜帶ApoE ε 4等位基因的皮質(zhì)下缺血性血管病(subcortical ischemic vascular disease，SIVD)患者較未攜帶者出現(xiàn)認(rèn)知障礙的風(fēng)險增高，但具體機(jī)制仍不明確。而在Bell et al[4]構(gòu)建的ApoE轉(zhuǎn)基因小鼠模型中顯示，親環(huán)素A(cyclophilin A，CypA)可能是ApoE ε 4等位基因引起腦血管功能異常及神經(jīng)元退行性變的關(guān)鍵因子。該研究為進(jìn)一步探索ApoE基因多態(tài)性及血清CypA濃度對SIVD患者認(rèn)知障礙的影響，進(jìn)行了下列研究。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1SVCI組 選取2017年9月～2018年4月安徽省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科SIVD住院患者126例，其中SVCI組為82例。SIVD納入標(biāo)準(zhǔn)參照Galluzzi et al[5]提出的影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并加以修改：① 年齡50～80歲； ② 受教育年限≥5年； ③ 頭顱磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)檢查示腦室旁和(或)深部白質(zhì)病變(white matter lesions，WML)及深部灰質(zhì)多發(fā)性腔隙性梗死灶(lacunar infarcts，LI)。所有入選患者知情同意并簽署知情同意書。SVCI診斷標(biāo)準(zhǔn)為：① 符合SIVD納入標(biāo)準(zhǔn)；② 患者有明確的認(rèn)知功能下降，蒙特利爾認(rèn)知評估量表(montreal cognitive assessment，MoCA)量表評分<26分，記憶、視空間、語言、執(zhí)行中≥1個認(rèn)知領(lǐng)域受損；③ 保留獨(dú)立生活能力；④ 認(rèn)知功能損傷與腦血管病間具有相關(guān)性：認(rèn)知功能損害發(fā)生在卒中后3個月內(nèi)；或無明顯腦血管病時間發(fā)生，但存在信息處理速度明顯減慢，且具有早期尿、便障礙、早期步態(tài)異常、人格和性格改變特征之一[6-7]。

1.1.2皮質(zhì)下缺血性血管病無認(rèn)知障礙組(SIVD withnon-cognitive impairment，SNCI)納入標(biāo)準(zhǔn) 選取同期年齡、性別相匹配，認(rèn)知功能正常(MoCA量表評分≥26分)的SIVD患者44例作為SNCI組。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ① 有腦外傷、皮質(zhì)梗死、腦出血、腦腫瘤史；② 有阿爾茲海默病、帕金森病、路易體癡呆等其他引起認(rèn)知損害的疾??；③ 代謝、多發(fā)性硬化、免疫等非血管因素引起的腦白質(zhì)病變；④ 有風(fēng)濕結(jié)締組織及炎性疾病、傳染病史；⑤ 患有嚴(yán)重的軀體或精神疾??；⑥ 不能配合神經(jīng)心理學(xué)評估者。

1.2 研究方法

1.2.1一般臨床資料的收集 收集所有入選者的年齡、性別、受教育程度、吸煙飲酒史、高血壓病史、糖尿病病史、癡呆及精神疾病家族史等一般資料，并記錄空腹血糖、血脂等指標(biāo)。

1.2.2神經(jīng)影像學(xué)評估 應(yīng)用3.0 T MRI機(jī)(德國西門子公司)掃描，依據(jù)頭顱MRI T 2像、液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列成像，從皮質(zhì)下LI數(shù)目及WML兩方面對所有受試者腦損傷程度進(jìn)行評估。LI定義為皮質(zhì)下直徑為3～15 mm、邊界清楚的缺血性病灶(皮質(zhì)下和/或腦室旁)[8]。腦白質(zhì)病變程度依據(jù)Fazekas et al[9]的分級方法分為3級：1級(輕度，斑點(diǎn)狀病變)；2級(中度，病變開始融合)；3級(重度，融合成彌漫性病變)。

1.2.3神經(jīng)心理學(xué)評估 采用MoCA量表、日常生活活動能力量表(activity of dailyliving scale，ADL)進(jìn)行整體認(rèn)知功能及日常生活能力評估；應(yīng)用哈金斯基缺血指數(shù)量表(hachinskiischemic score，HIS)鑒別SVCI和老年性認(rèn)知障礙、漢密頓抑郁量表(hamilton depression scale，HAMD)評估抑郁狀態(tài)。

1.2.4血液標(biāo)本的收集和檢測 采取受試者空腹外周靜脈血A、B兩管各4 ml，A管為聚丙烯EDTA抗凝真空采血管，4 ℃冰箱內(nèi)保存，進(jìn)行ApoE基因測序；B管未添加抗凝劑，采血后立即3 000 r/min離心10 min，分離血清并保存于-80 ℃冰箱中，檢測CypA濃度。

1.2.4.1ApoE基因檢測方法 采用snapshot檢測方法檢測所有受試者ApoE基因型，按試劑盒操作步驟對共ApoE共2個SNP位點(diǎn)擴(kuò)增檢測。① 提取白細(xì)胞DNA；② PCR擴(kuò)增：設(shè)計引物序列，反應(yīng)條件：96 ℃、1 min，96 ℃、10 s，60 ℃、30 s，52 ℃、5 s共30個循環(huán)；③ DNA測序：取1 μl延伸產(chǎn)物，加10 μl高度去離子甲酰胺，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀(Snapshot試劑盒、3730 XL基因測序儀均購自美國ABI公司)。

1.2.4.2CypA含量測定 應(yīng)用ELISA法測定血清CypA濃度。操作方法嚴(yán)格按照試劑盒(購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：201804)說明書進(jìn)行。

表1 SVCI和SNCI兩組一般臨床資料及血清CypA濃度比較

a采用χ2檢驗；b采用Mann-WhitneyU檢驗；c采用獨(dú)立樣本t檢驗；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

表2 SVCI和SNCI兩組ApoE基因型與等位基因頻率分布比較[n(%)]

a采用Fisher確切概率檢驗

2 結(jié)果

2.1 SVCI和SNCI兩組一般臨床資料及血清CypA濃度比較SVCI和SNCI兩組間在受教育年限、吸煙飲酒史、糖尿病比例、Fazekas分級等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與SNCI組比較，SVCI中的高血壓比例、年齡、總膽固醇水平及LI數(shù)量等方面較SNCI組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SVCI組血清CypA濃度高于SNCI組(P<0.01)。見表1。

2.2 SVCI和SNCI兩組ApoE基因頻率的比較SVCI組中共檢出2/2、2/3、2/4、3/3、3/4、4/4 6種基因型以及ε 2、ε 3、ε 4 3種等位基因；SNCI組中共檢出2/3、2/4、3/3、3/4、4/4 5種基因型以及ε 2、ε 3、ε 4 3種等位基因。其中SVCI組中3/4基因型及ε 4等位基因頻率(25.6%/20.7%)顯著高于SNCI組(6.8%/6.8%)，3/3基因型及ε 3等位基因頻率(51.2%/70.1%)明顯低于SNCI組(81.8%/88.6%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 ε 4基因攜帶組和ε 4基因非攜帶組兩組間血清CypA濃度的比較ε 4基因攜帶組血清CypA濃度較ε 4基因非攜帶組高(ε 4等位基因攜帶組包括基因型為ApoE 2/4、ApoE 3/4、ApoE 4/4者，ε 4等位基因非攜帶組包括基因型為ApoE 2/2、ApoE 2/3、ApoE 3/3者)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 兩組間血清CypA濃度的比較

2.4 SVCI組危險因素logistic回歸分析以有無SVCI作為因變量(SVCI=1，SNCI=0)，將SVCI主要的危險因素進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析(自變量賦值為如下：有高血壓=1，無高血壓=0；攜帶ε 4基因=1，未攜帶ε 4基因=0；其余變量均以連續(xù)性變量直接納入模型分析)，結(jié)果顯示：高血壓、血清總膽固醇水平增加、血清CypA濃度的增加以及攜帶ε 4等位基因，均增加SVCI的發(fā)病風(fēng)險(P<0.05)。見表4。

3 討論

ApoE基因位于19號染色體長臂上，具有ε 2、ε 3及ε 4 3種不同的等位基因，研究普遍認(rèn)為在3種等位基因中，攜帶ε 4等位基因者體內(nèi)LDL-C水平及出現(xiàn)動脈粥樣硬化的風(fēng)險較高[10]，且會加劇腦白質(zhì)損傷、引起認(rèn)知功能減退[11]，與SVCI具有相關(guān)性[3]。目前為止，已有不少研究者[12-14]從顱內(nèi)β淀粉蛋白沉積、動脈粥樣硬化及血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞等不同方面進(jìn)行發(fā)病機(jī)制的探索，但ε 4等位基因和SVCI之間具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。

表4 SVCI影響因素多因素logistic回歸分析

CypA作為親環(huán)素家族中的一員，參與了蛋白質(zhì)折疊、膽固醇的代謝、免疫功能的調(diào)節(jié)和機(jī)體炎性反應(yīng)等許多生物學(xué)過程，與冠心病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病關(guān)系密切[15]，近年來也有研究[16]顯示CypA在腦血管病中發(fā)揮重要作用。

本研究檢測了SVCI組和SNCI組ApoE基因多態(tài)性及血清CypA濃度，旨在進(jìn)一步探索SVCI與ApoE基因多態(tài)性及血清CypA濃度之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，SVCI組患者的ε 4等位基因頻率及血清CypA濃度均高于SNCI組，提示ε 4等位基因和CypA在SVCI發(fā)病過程中可能發(fā)揮一定作用。為了進(jìn)一步分析ε 4等位基因和CypA是否具有協(xié)同作用，本研究將入組患者根據(jù)是否攜帶ε 4等位基因重新分組，對兩組血清CypA濃度進(jìn)行比較，結(jié)果顯示ε 4等位基因攜帶組血清CypA濃度較非攜帶者高。

通過對上述研究結(jié)果進(jìn)行討論與總結(jié)，ε 4等位基因和CypA促進(jìn)SVCI的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制可能如下：① ε 4等位基因和CypA均可引起小動脈硬化、脂質(zhì)斑塊形成，導(dǎo)致血管管腔狹窄甚至閉塞、腦血流灌注不足，從而出現(xiàn)皮質(zhì)下LI或白質(zhì)缺血性改變，破壞額葉-皮質(zhì)下環(huán)路或(和)丘腦皮質(zhì)環(huán)路，表現(xiàn)出以執(zhí)行功能受損為主的認(rèn)知功能減退[6]；② ε 4等位基因可通過激活CypA-MMP-9途徑，引起B(yǎng)BB的破壞。CypA是一種前炎癥因子，當(dāng)機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下，由受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞分泌，CypA可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，如MMP-2和MMP-9的活化[17]，進(jìn)而降解BBB的緊密連接蛋白、膠原蛋白IV和一些基膜蛋白，破壞BBB的完整性，從而造成神經(jīng)元攝取多種血源性神經(jīng)毒性物質(zhì)，最終引起認(rèn)知功能下降。但由于本研究樣本量有限，上述機(jī)制還需要大樣本、多中心的研究來進(jìn)一步進(jìn)行驗證。

同時本研究對SVCI影響因素進(jìn)行了多因素分析，結(jié)果顯示除攜帶ε 4等位基因和血清CypA濃度增高外，高血壓及血清總膽固醇水平增高也會增加SVCI的發(fā)病風(fēng)險，這與國內(nèi)外相關(guān)研究[18-19]結(jié)果一致，故而控制上述因素對預(yù)防SVCI具有重要意義。