葉石才，鄭學(xué)寶,2，朱 朱，周 宇，鐘 宇，黃 哲，王永存，葉 華，鄒 穎，馮錦山，遲宏罡，朱宇珍

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率在男性和女性患者中均位列第三位。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，已躍居為我國(guó)排第四位的惡性腫瘤性疾病，中晚期占大多數(shù)[1]。不同臨床分期的結(jié)直腸癌的治療方法不同，準(zhǔn)確判斷腫瘤的病理及臨床分期非常重要。結(jié)直腸癌是多基因改變、多因素影響、多階段發(fā)展的高度惡性腫瘤，其中宿主的遺傳易感性在結(jié)直腸癌發(fā)病中的作用越來(lái)越受到重視[2]。目前已發(fā)現(xiàn)多種基因直接參與和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，并決定這人群或個(gè)體易感性的差異[3-7]。

IL-22是IL-10家族成員之一，介導(dǎo)上皮免疫和黏膜組織修復(fù)，主要由激活的αβ T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、NK T細(xì)胞和固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells，ILCs)分泌。目前諸多研究[8]表明IL-22在結(jié)直腸癌的天然和獲得性保護(hù)性免疫中起重要作用，且參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的信號(hào)通路，但宿主基因?qū)ζ涔δ艿恼{(diào)控及其與結(jié)直腸癌的易感性的關(guān)系尚不清楚。有關(guān)IL-22基因多態(tài)性可能與結(jié)直腸癌易感性的研究鮮有報(bào)道。該研究主要是對(duì)IL-22基因單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行研究，探討SNP位點(diǎn)(rs2227474和rs2227483)與結(jié)直腸癌發(fā)病的關(guān)系，以及其是否與結(jié)直腸癌患者的臨床特點(diǎn)、病理特征有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑和儀器 全血DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；熱啟動(dòng)Taq酶購(gòu)自日本TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；紫外分光光度計(jì)NanoDrop購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR-7500儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.1.2病例資料 選取廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院確診結(jié)直腸癌患者306例。按照《結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2015年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)磁共振成像(MRI)或計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)檢查腫瘤大小和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。臨床階段根據(jù)國(guó)際癌癥防治聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。結(jié)直腸癌患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查或在抽血前沒(méi)有接受治療。健康對(duì)照組為醫(yī)院體檢者358例。所有研究對(duì)象簽署由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書(shū)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取及純化 用肝素鋰抗凝管收集靜脈血，采用Qiagen 全血DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。質(zhì)量控制：取DNA樣本2 μl，用紫外分光光度計(jì)NanoDrop測(cè)定DNA純度和濃度，若OD260/OD280>1.8，OD260/OD230>2.0，則DNA純度合格。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)采用7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件Primer Express 3.0設(shè)計(jì)。rs2227473和rs2227483位點(diǎn)設(shè)計(jì)的兩條探針?lè)謩e采用美國(guó)AB公司的VIC和FAM 進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.2.3SNP等位基因分型 取純度合格的DNA樣本，在384孔板擴(kuò)增待測(cè)樣本，反應(yīng)體系為10 μl，其中通用PCR混合液(2×TaqMan genotyping Master Mix)5 μl，引物與探針混合液(40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix)0.25 μl，DNA(50 ng/μl)1 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，若樣本為等位基因1的純合子時(shí)，僅可檢測(cè)到VIC熒光；若樣本為等位基因2的純合子時(shí)，僅可檢測(cè)到FAM熒光；若樣本為雜合子時(shí)，可同時(shí)檢測(cè)到FAM和VIC兩種熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用χ2檢驗(yàn)確定結(jié)直腸癌組與健康對(duì)照組的等位基因頻率的差異，進(jìn)一步通過(guò)計(jì)算比值比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(95% confidence intervals，95%CI)來(lái)評(píng)估結(jié)直腸癌發(fā)生與IL-22等位基因的相關(guān)性。分析結(jié)直腸癌患者不同基因型與臨床病理表型的相關(guān)性，如年齡、性別、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、原發(fā)腫瘤延長(zhǎng)、淋巴結(jié)狀態(tài)、轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等。

2 結(jié)果

2.1 研究人群特征結(jié)直腸癌組和健康對(duì)照組之間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.483，P>0.05)。 其中結(jié)直腸癌組和健康對(duì)照組性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.576，P>0.05)，提示結(jié)直腸癌組和健康對(duì)照組間具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 研究人群特征

2.2 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性的關(guān)聯(lián)性分析通過(guò)對(duì)兩組人群rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的基因分型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示rs2227473位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性相關(guān)，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 3)，rs2227483位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性無(wú)相關(guān)性(P=0.99)。見(jiàn)表2。

2.3 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌CEA的關(guān)聯(lián)性分析血清CEA水平能預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的預(yù)后及復(fù)發(fā)，是應(yīng)用于臨床的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物中重要的一種。通過(guò)分析結(jié)直腸癌患者rs2227473、rs2227483位點(diǎn)多態(tài)性與CEA的相關(guān)性，結(jié)果顯示rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性無(wú)相關(guān)性(P=0.93，P=0.88)，見(jiàn)表3。

表2 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性的關(guān)聯(lián)性分析

表3 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌CEA的關(guān)聯(lián)性分析

表4 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤(T)的關(guān)聯(lián)性分析

表5 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌區(qū)域淋巴結(jié)(N)的關(guān)聯(lián)性分析

表6 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌區(qū)域遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性分析

表7 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床分期的關(guān)聯(lián)性分析

2.4 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤(T)的關(guān)聯(lián)性分析統(tǒng)計(jì)分析rs2227473、rs2227483位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤的相關(guān)性，結(jié)果顯示rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤的浸潤(rùn)程度無(wú)相關(guān)性(P=0.71，P=0.84)，見(jiàn)表4。

2.5 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌區(qū)域淋巴結(jié)(N)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P=0.76，P=0.71)，見(jiàn)表5。

2.6 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌區(qū)域遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性分析通過(guò)對(duì)rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌區(qū)域遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示，二者均無(wú)相關(guān)性(P=0.39，P=0.92)，見(jiàn)表6。

2.7 rs2227473、rs2227483位點(diǎn)的多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床分期的關(guān)聯(lián)性分析根據(jù)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)直腸癌患者分為Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期。結(jié)果顯示，rs2227473位點(diǎn)G在Ⅰ+Ⅱ期患者中的基因頻率為80.3%，在Ⅲ+Ⅳ期患者中的基因頻率為91.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。rs2227483位點(diǎn)在Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表7。

3 討論

結(jié)直腸癌易感基因的篩選和確定，不僅是結(jié)直腸癌發(fā)生高危人群預(yù)測(cè)診斷和制定相應(yīng)干預(yù)決策的依據(jù)，同時(shí)也是結(jié)直腸癌靶向基因和藥物治療的基礎(chǔ)。隨著結(jié)直腸癌易感基因研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)有大量的易感基因SNP與結(jié)直腸癌易感性存在相關(guān)性。COX-2基因多態(tài)性-765G/C與結(jié)腸直腸癌特別是直腸乙狀結(jié)腸癌的易感性增加有關(guān)[4]；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)插入/缺失(I/D)多態(tài)性可能增加結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]；IL-10基因-592A/C降低了結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[6]；細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)基因K469E多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性和多藥耐藥性高度相關(guān)[7]； MYCrs11777210被證實(shí)是結(jié)腸直腸癌高風(fēng)險(xiǎn)基因多態(tài)性位點(diǎn)，可作為潛在預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物之一[8-10]。

IL-22早期研究主要集中在炎癥性疾病與自身免疫性疾病，最近研究[10]表明，IL-22在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。Zhuang et al[11]通過(guò)免疫熒光雙染的方法證實(shí)了胃癌組織中存在Th22細(xì)胞的表達(dá)；通過(guò)對(duì)76例胃癌患者研究進(jìn)行分析，顯示腫瘤組織中CD4+IL-22+T細(xì)胞比例在腫瘤組織中明顯高于腫瘤引流淋巴結(jié)、非腫瘤以及癌旁組織。同時(shí)該研究還顯示Th22細(xì)胞低表達(dá)的患者在21個(gè)月的生存率方面明顯優(yōu)于高表達(dá)的患者，表明Th22細(xì)胞的髙表達(dá)意味著較差的預(yù)后。Liu et al[10]通過(guò)對(duì)32例胃癌患者和19例健康志愿者外周血的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)IL-22的輔助性T細(xì)胞和Th22細(xì)胞在胃癌患者中高度表達(dá)，同時(shí)Th22細(xì)胞旳比例與IL-22濃度呈正相關(guān)性，IL-22在進(jìn)展期胃癌患者的表達(dá)量明顯高于早期胃癌患者，表明IL-22與胃癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)。研究表明結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織中均存在IL-22蛋白的表達(dá)，但腫瘤組織中表達(dá)更為明顯，且TNM Ⅰ～Ⅳ期的Th22細(xì)胞比例明顯髙于TNM Ⅰ～Ⅱ期，提示IL-22細(xì)胞結(jié)直腸癌微環(huán)境中聚集，并且隨著腫瘤的進(jìn)展含量增高，表明IL-22或許可以作為結(jié)直腸癌患者評(píng)價(jià)預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)[11-12]。

人IL-22基因位于12q15，大約距離IL-26編碼基因上游52 kb，距離IFNG編碼基因上游99 kb。整個(gè)編碼區(qū)位于30 785 331 nt～30 790 587 nt 之間的約5.3 kb，共包含5個(gè)外顯子。開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度537 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度179個(gè)氨基酸[10]。IL-22及其受體(IL-22RA1/IL-22RA2)基因單核苷酸多態(tài)性與多種疾病的易感性有關(guān)，包括炎癥反應(yīng)性疾病、腫瘤和慢性感染性疾病。其中，IL-22基因SNP(rs1179251)被報(bào)道與大腸癌易感性有關(guān)[12]；IL-22基因SNP(rs1012356、rs1179251和rs2256111)可能與 HCV感染后的病毒清除和干擾素治療應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)[13]，此外，IL-22RA1 基因SNP(rs4292900、rs4648936和rs16829225)與重癥慢性鼻鼻竇炎的發(fā)生密切相關(guān)[14]；IL-22RA2基因SNP(rs276474)與多發(fā)性硬化的發(fā)生有關(guān)，其具體機(jī)制與 IL-22RA2 基因多態(tài)性對(duì)巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)有關(guān)[15]。本研究檢測(cè)了結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照者IL-22兩個(gè)SNP位點(diǎn)(rs2227483和rs2227473)的多態(tài)性，結(jié)果提示IL-22基因rs2227473位點(diǎn)與結(jié)直腸癌的易感性有相關(guān)性；除此以外，IL-22基因rs2227473位點(diǎn)與臨床分期有顯著相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明，IL-22基因rs2227473位點(diǎn)不僅參與癌癥的起始，而且可能參與結(jié)腸直腸癌的進(jìn)展。但是這個(gè)位點(diǎn)與CEA、原發(fā)腫瘤擴(kuò)展情況、淋巴結(jié)狀態(tài)和轉(zhuǎn)移情況的參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)性。因此，推斷IL-22基因型可能是結(jié)直腸癌患者生存的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，IL-22基因rs2227473多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性和臨床分期相關(guān)，其中攜帶等位基因G增加結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但本研究的研究對(duì)象具有樣本量小、地域局限和人種差異小等缺陷，因此，為進(jìn)一步揭示IL-22基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的關(guān)系，在不同國(guó)家、地區(qū)和種族的人群中進(jìn)行大樣本的研究是很有必要。