產(chǎn)進中,劉 中,黃 俊,張 麗,張 野,何淑芳

缺血性心臟病是目前全球致死率最高的心血管疾病[1-2]。其中心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[3]。外泌體(exosome，Exo)是細胞主動向胞外分泌的一種囊泡樣小體，直徑約為30～100 nm，其可通過運輸?shù)鞍踪|(zhì)、RNA或微小RNA (microRNA，miRNA)等物質(zhì)，靶向作用于細胞，是細胞間信號通訊的重要方式之一[4]。研究[5]表明Exo在心血管疾病中可以發(fā)揮重要的心肌保護效應(yīng)。然而，關(guān)于Exo是否參與缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning, IPC)[6]介導(dǎo)的心肌保護效應(yīng)，目前尚未報道。因此，該研究擬通過探討IPC處理后從血清提取的Exo對心肌I/R損傷的影響，以研究IPC發(fā)揮心肌保護作用的新機制和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料ExoQuickTM外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司；2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海碧云天科技研究所；抗白細胞分化抗原(cluster of differentiation，CD 63)、抗熱休克蛋白(heat shock protein，HSP60)抗體均購自美國Santa Cruz公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；氯化三苯基四氮唑(TTC，129K1867V)購自美國Sigma公司；肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)購自美國Beckman Coulter公司；HX-300S型動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司；PowerLab系統(tǒng)購自澳大利亞AD公司；冷凍透射電鏡購自中國科技大學(xué)生命科學(xué)院；Tanon全自動凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有公司。

1.2 I/R模型建立清潔級健康雄性SD大鼠38只，體質(zhì)量250～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。大鼠經(jīng)腹腔注射5%戊巴比妥50 mg/kg麻醉下，行氣管切開插管，連接動物呼吸機，以室內(nèi)空氣通氣，潮氣量為20～30 ml/kg，呼吸頻率為70～80次/min。行左頸動脈切開置管，通過壓力換能器，連接PowerLab系統(tǒng)，記錄心電圖、平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)。行右頸內(nèi)靜脈切開置管用于輸液和給藥。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm，在第4、5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟。在肺動脈圓錐與左心耳之間冠狀動脈處用6-0 Prolene線作一線結(jié)，把心臟放回胸腔，穩(wěn)定15 min后開始缺血再灌注損傷實驗，即收緊線結(jié)即完成左冠狀動脈閉塞致心肌缺血，表現(xiàn)為其支配的局部心肌發(fā)紺、血壓下降、ST段抬高或降低；松開線結(jié)即行再灌注處理。

1.3 Exo的分離提取取8只大鼠隨機分為2組(n=4)：IPC組，先進行IPC，即對心肌行缺血5 min，再灌注5 min，重復(fù)3次。處理結(jié)束即刻經(jīng)頸動脈快速取血置于含促凝劑的采血試管內(nèi)，獲取血清，利用ExoQuickTM試劑盒提取Exo，加入100 μl PBS重懸，經(jīng)0.22 μm的無菌濾膜除菌，于-80 ℃保存，標(biāo)記為缺血預(yù)處理外泌體(Exo-IPC)。對照組(CON)，僅穿線不進行任何處理，30 min后獲取血清，然后以相同方法提取外泌體，標(biāo)記為對照外泌體(Exo-CON)。

1.4 Exo鑒定分析將10 μl混懸均勻的Exo溶液滴在載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min后，液體用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去。用10 g/L磷鎢酸(pH 6.8)滴于銅網(wǎng)上，室溫負染5 min，濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體，待常溫下干燥后，80～120 kv上機成像。用冷凍透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)，并隨機選取視野，拍攝照片，用標(biāo)尺計算直徑。冰上解凍外泌體，加入5×上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白變性，常規(guī)制膠、上樣，蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入5% BSA稀釋的一抗HSP60(1 ∶500)或CD63(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗滌3次，每次10 min，在山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)或山羊抗兔IgG(1 ∶20 000)中室溫孵育1 h，TBST液漂洗3次，每次5 min，采用ECL發(fā)光試劑盒，在Tanon全自動凝膠成像系統(tǒng)中自動曝光采集圖像。

1.5 Exo濃度測定參照文獻[7]方法，將提取的Exo樣品利用2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白定量法測定提取Exo濃度。分別取待測Exo-IPC、Exo-CON樣品各5 μl稀釋10倍后，嚴(yán)格按照BCA試劑盒的說明書測量各樣品的濃度，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。

1.6 實驗動物分組及給藥方法大鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組(n=6)：假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、I/R+Exo-IPC組、I/R+Exo-CON組、溶劑對照組(I/R+PBS組)。I/R+Exo-IPC組、I/R+Exo-CON組、I/R+PBS組分別于缺血前15 min經(jīng)頸靜脈一次性給予Exo-IPC(0.4 μg/μl)、Exo-CON(0.4 μg/μl)以及PBS各100 μl。除Sham組外，其余各組均給予缺血30 min，再灌注120 min處理。

1.7 血清肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)測定于再灌注120 min結(jié)束后，經(jīng)頸動脈取血，離心分離血清，放入-80 ℃保存。嚴(yán)格按照cTnI測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)要求測定各組血清cTnI水平。

1.8 心肌梗死體積測定實驗結(jié)束后取出心臟，去除非心臟組織，生理鹽水灌注，沖洗出血液，結(jié)扎左冠狀動脈，從主動脈注入0.25% Evan藍溶液。置于-80 ℃冰箱中，待充分冷凍后，行冰凍切片，沿心臟縱軸線切5～6片，每片厚約2 mm。切片放于1%氯化三苯基四氮唑溶液中，37 ℃水浴鍋中孵育15 min；隨后用10%中性福爾馬林固定過夜，缺血危險區(qū)中呈白色為梗死區(qū)，呈紅色為非梗死區(qū)。采用Imaging J 1.38e圖像分析軟件分析左心室(left ventricular area，LV)、右心室(right ventricular area，RV)、缺血危險區(qū)(area at risk，AAR)和梗死區(qū)(infarct size，IS)的面積，乘以0.2 cm即為各區(qū)的體積，并計算LV體積與RV體積之和(LV+RV)、IS體積與AAR體積以及IS/ARR比值。

2 結(jié)果

2.1 Exo的鑒定分析通過透射電鏡觀察納米級別的Exo形態(tài)，可見大小均一的微型囊體結(jié)構(gòu)，直徑約30～100 nm左右，形態(tài)為圓形或橢圓形，在邊緣可觀察到類似細胞膜的雙層膜結(jié)構(gòu)，見圖1。Western blot 結(jié)果顯示：Exo-IPC的Exo特異性蛋白標(biāo)志物HSP60(t=4.009，P<0.05)和CD63(t=3.905，P<0.05)的相對表達量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2A、2B 。BCA法測定血清Exo濃度，結(jié)果顯示：Exo-IPC中Exo濃度顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.066，P<0.05)，見圖2C。

2.2 心肌梗死體積各組LV+RV體積及AAR體積差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Sham組比較，其余各組的IS體積和IS/AAR比值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.28，P<0.01)；與I/R組比較，I/R+Exo-IPC組的IS體積和IS/AAR比值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.209，P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Exo-CON組、I/R+PBS組的IS體積和IS/AAR比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖1 外泌體透射電鏡觀察形態(tài)學(xué)結(jié)果A：bar=200 nm;B:bar=100 nm

圖2 Western blot 檢測外泌體表面蛋白標(biāo)志物以及BCA法測定外泌體濃度

A、B：HSP60、CD63表達；C：外泌體濃度；與Exo-CON比較：*P<0.05

2.3 cTnI水平與Sham組比較，其余各組再灌注120 min時血清cTnI濃度均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.14，P<0.01)；與I/R組比較，I/R+Exo-IPC組血清cTnI濃度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.013，P<0.05)；與I/R組比較，I/R+Exo-CON組、I/R+PBS組血清cTnI濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清cTnI水平的比較

與Sham組比較：*P<0.01；與IR組比較：#P<0.05

3 討論

臨床上心肌梗死溶栓、冠脈搭橋術(shù)和心臟瓣膜置換術(shù)等治療方法都會涉及心肌I/R損傷這一重要的病理生理過程，預(yù)防和減輕心肌I/R損傷是目前臨床上急需解決的問題。Exo作為細胞主動向胞外釋放的具有一定生物活性功能的小囊泡，在心肌缺血后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和組織修復(fù)過程中可能發(fā)揮著重要作用[8]。本研究通過提取IPC處理后大鼠血清中的Exo，將其注入受體大鼠體內(nèi)，證明這些Exo可減輕受體大鼠心肌I/R損傷，降低心肌梗死面積和cTnI水平，提示預(yù)處理誘導(dǎo)釋放的內(nèi)源性Exo可能成為促進心肌缺血后組織損傷修復(fù)的潛在治療措施。

本研究參照文獻[9]利用ExoQuickTM試劑盒提取大鼠血清中的Exo。根據(jù)文獻[10]報道，電鏡下Exo為直徑介于30～100 nm之間的類似橢圓形結(jié)構(gòu)的納米級雙層膜囊泡，本研究在透射電鏡下觀察到的結(jié)果與其相符合。CD63、HSP60是目前鑒定Exo主要的表面標(biāo)志性蛋白[11-12]，本研究采用Western blot檢測顯示提取的外泌體CD63、HSP60均為陽性表達，且Exo-IPC中外泌體特異性的蛋白標(biāo)志物相對表達量增高。同時，本研究還顯示經(jīng)過IPC后，大鼠血清Exo的濃度明顯增加，表明IPC可刺激機體大量釋放內(nèi)源性Exo，從而增加其在血清內(nèi)的含量。有報道[13]顯示，當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)下時，細胞會迅速增加Exo的分泌量并改變其內(nèi)容物的成分，并對機體產(chǎn)生不同程度的影響。Vicencio et al[11]研究顯示，對自愿者和大鼠分別進行遠端缺血預(yù)處理同樣顯著地增加了兩者血漿中Exo的水平。

圖3 TTC染色法檢測各組大鼠心肌梗死

在心肌I/R損傷前，本研究將IPC誘導(dǎo)釋放的血清Exo注入大鼠靜脈內(nèi)，可明顯減小心肌梗死面積，同時血清cTnI水平也相應(yīng)地降低，然而對照組Exo對I/R損傷不產(chǎn)生保護效應(yīng)，這一結(jié)果提示IPC可通過刺激機體釋放具有保護性作用的內(nèi)源性Exo途徑，來減輕缺血和再灌注引起的心肌損傷。Exo在預(yù)處理介導(dǎo)的心肌保護效應(yīng)中發(fā)揮何種作用及其相關(guān)機制，目前國內(nèi)外研究還很少。Giricz et al[12]報道，離體灌流的供體心臟經(jīng)過3次(每次5 min)的IPC處理后，其冠脈流出液中的細胞外囊泡(其中包含有Exo)，有助于減輕受體心臟的I/R損傷。遠端缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的內(nèi)源性外泌體可能通過轉(zhuǎn)運HSP70蛋白，激活心肌細胞內(nèi)細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和p38通路發(fā)揮心肌保護作用[11]。最新研究[14-15]還證實，經(jīng)過缺氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞所分泌的Exo中含有大量的miRNA-22和miRNA-221，可通過作用于心肌細胞凋亡調(diào)控因子而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。本研究通過IPC誘導(dǎo)機體釋放Exo，研究內(nèi)源性Exo心肌保護中的作用，但其具體作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，IPC可誘導(dǎo)大鼠血清Exo釋放增加，這種內(nèi)源性的Exo可減輕受體大鼠心肌I/R損傷，為研究IPC的心肌保護機制提供了新的方向以及的理論依據(jù)。