王多梅,宋 夢,汪 楓，2,周 青,汪 淵

角膜是眼球最外層的纖維膜，同時也是重要的屈光間質(zhì)。其中角膜上皮是抵御病原微生物侵襲角膜的第一道屏障，角膜最外層的上皮細(xì)胞間形成的高密度緊密連接構(gòu)成了屏障，將外界與眼內(nèi)隔離，抵御外界致病因子的侵襲[1]。上皮遭受損傷后，極易發(fā)生感染性炎癥。

全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)是天然維生素A的代謝產(chǎn)物。研究[2]表明，ATRA可改善血管內(nèi)皮依耐性舒張功能。維甲酸類化合物對多種細(xì)胞癌變和腫瘤的生長均有抑制作用，同時可以增強(qiáng)上皮細(xì)胞的生長和分化[3]，并且近幾年已被用于眼科相關(guān)疾病[4-5]。該研究通過ATRA處理損傷后大鼠角膜上皮，旨在探討ATRA對角膜上皮損傷修復(fù)過程中角膜上皮修復(fù)速度的影響及該過程中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路相關(guān)分子的變化及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，初步探討其發(fā)生的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物普通雄性清潔級SD大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗動物均給予12 h光照、12 h黑暗條件，環(huán)境通風(fēng)，飲水自由。

1.2 主要試劑二甲基亞砜(DMSO)購自美國 Sigma公司；TUNEL(C1090)細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；一抗β肌動蛋白(β-actin)、半胱天冬氨酸蛋白酶-9(cysteine aspartic acid specific protease-9，Caspases-9)、磷酸化p38蛋白(p-p38)、p38購自美國Santa Cruz公司 ；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2 assaciated X protein，Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠、羊抗兔、兔抗羊IgG購自美國Millipore 公司；Caspases-3購自美國Abcam 公司； ECL顯色試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉(sodium carmellose ，SC)購自美國 Sigma公司；ATRA購自上海東蒼生物科技有限公司(≥98% 302-79-4)。

1.3 儀器冰凍切片機(jī)、正置顯微鏡、解剖顯微鏡購自德國 Leica公司；電泳儀購自美國Pca 300公司；全自動數(shù)碼凝膠化學(xué)發(fā)生儀購自上海歐翔科學(xué)儀器有限公司；裂隙燈顯微鏡(YZ5T)購自蘇州六六視覺科技股份有限公司；脫色搖床(TS-1)購自海門其林貝爾儀器制造有限公司；往復(fù)式脫色搖床(ZD-9550)購自太倉華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)購自美國Thermo fisher公司。

1.4 大鼠角膜損傷修復(fù)模型的建立及角膜組織收取所有大鼠稱重后10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉, 角膜環(huán)鋸器在大鼠角膜上皮做直徑4 mm環(huán)形標(biāo)記，解剖顯微鏡下用無菌的手術(shù)刀片刮除并收集環(huán)形標(biāo)記內(nèi)角膜上皮。術(shù)后損傷眼均涂抹紅霉素眼膏以防感染。損傷修復(fù)期間每只老鼠一只眼滴加0.5 mmol/L ATRA滴眼液(溶于2% SC)，另一只眼滴加對照溶液(2% SC)，每天4次，每次每只眼10 μl。角膜損傷0、12、24、36 h分別滴加熒光染液并拍照記錄兩只眼角膜損傷修復(fù)情況。待最后一次拍照結(jié)束后，處死動物。收取一部分大鼠兩只眼角膜最佳切削溫度化合物(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋劑包埋，凍存于-80 ℃用于切片原位末端凋亡法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)實驗分析，一部分大鼠角膜上皮刮取之后直接-80 ℃凍存用于Western blot實驗。

1.5 大鼠角膜上皮TUNEL細(xì)胞凋亡分析-80 ℃保存的大鼠OCT角膜標(biāo)本于冰凍切片機(jī)切出厚度5 μm組織切片。室溫干燥后用預(yù)冷的冰丙酮固定10～20 min； PBS洗滌2次，每次5 min，加入含0.1% TRIton X-100的PBS，冰浴孵育2 min；PBS洗滌3次，每次5 min；在樣品上加45 μl TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min；PBS洗滌3次，每次5 min；用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.6 大鼠角膜組織蛋白印記實驗分析凋亡蛋白表達(dá)-80 ℃保存的大鼠角膜上皮組織4 ℃、14 000 r/min離心15 min；加入蛋白裂解液冰上裂解30 min；4 ℃、14 000 r/min離心15 min取上清液，加入一定比例蛋白上樣緩沖液，沸水煮10 min。配制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，蛋白樣本于凝膠中運(yùn)動，根據(jù)分子量大小不同，不同分子量蛋白跑至不同位置；后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；含0.05%吐溫20的三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline+0.05% Tween20，TBST)洗滌1次，三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline ，TBS)洗1次，每次10 min；4 ℃一抗過夜；TBST洗滌3次，每次10 min；室溫孵育對應(yīng)HRP標(biāo)記二抗2 h，TBST洗滌3次，TBS洗1次；避光加發(fā)光劑后曝光并采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 ATRA促進(jìn)大鼠角膜上皮損傷修復(fù)損傷后0、12、24、36 h分別拍照記錄大鼠角膜損傷修復(fù)情況。 通過大鼠角膜上皮損傷修復(fù)體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?，滴加?.5 mmol/L ATRA滴眼液眼角膜損傷修復(fù)恢復(fù)率12、24、36 h分別為17.85%、53.25%、77.80%，對照(control，CT)組12、24、36 h恢復(fù)率分別為15.47%、45.59%、65.07%。見圖1。初步說明ATRA可促進(jìn)大鼠角膜上皮損傷修復(fù)的進(jìn)行。

圖1 ATRA對大鼠角膜上皮損傷修復(fù)的影響1、2、3：大鼠編號

2.2 ATRA可抑制角膜上皮損傷修復(fù)過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生大鼠角膜組織TUNEL結(jié)果顯示，ATRA處理后角膜上皮細(xì)胞凋亡明顯少于CT組和空白組(角膜損傷0 h未處理直接取材角膜)。見圖2。

2.3 ATRA對角膜上皮組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白影響Western blot實驗結(jié)果顯示：與CT組比較，損傷修復(fù)之后，ATRA處理角膜上皮組織中促凋亡蛋白Bax表達(dá)量明顯下降(F=2.589E3,P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯上調(diào)(F=4.808E3,P<0.05)，Bcl-2/Bax比值A(chǔ)TRA處理后明顯增多(F=1.563E4,P<0.05)。見圖3。由此說明ATRA能抑制角膜上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而對大鼠角膜損傷修復(fù)進(jìn)程起促進(jìn)作用。 同時Caspases家族蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：ATRA處理后角膜上皮組織Caspases-9(F=2.334E3,P<0.05),Caspases-3(F=1.536E3,P<0.05)表達(dá)明顯降低，而其前體蛋白Procaspases-9(F=1.495E3,P<0.05), Procaspases-3(F=415.542,P<0.05)表達(dá)均高于CT組。 見圖4。

2.4 ATRA對角膜上皮組織MAPK通路相關(guān)蛋白影響ATRA處理后Western blot檢測MAPK通路蛋白結(jié)果顯示：p38磷酸化水平ATRA處理組均下調(diào)(F=1.350E3,P<0.05)，見圖5。說明ATRA可能通過對MAPK通路蛋白活性的調(diào)節(jié)，從而對角膜上皮組織細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用。

圖2 ATRA對角膜上皮組織凋亡影響 TUNEL染色×100

圖3 ATRA對角膜上皮組織凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

1：未損傷ATRA處理角膜上皮；2：未損傷 CT角膜上皮；3：角膜損傷36 h ATRA處理角膜上皮；4：角膜損傷36 h CT角膜上皮；與未損傷組1比較：*P<0.05；與CT組4比較：#P<0.05

3 討論

角膜損傷修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，該過程與多種因素密切相關(guān)。研究表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物通過活性氧的形成從而延緩角膜損傷修復(fù)的速度[6]，吸煙會延緩人角膜上皮損傷修復(fù)的速度[7]，血鈣濃度過高，會延緩去卵巢大鼠角膜損傷修復(fù)的速度[8]。角膜傷口愈合是在多種眼部手術(shù)及眼部損傷例如眼部化學(xué)灼傷引起的眼外傷后獲得視力最佳恢復(fù)的必要臨床步驟。角膜上皮作為抵御外界病原體入侵的第一道屏障，角膜損傷可導(dǎo)致視力減退，嚴(yán)重者可使角膜脫落、穿孔，導(dǎo)致失明。加快角膜損傷修復(fù)可以盡可能降低這些威脅的發(fā)生。因此，對有效促進(jìn)角膜上皮損傷修復(fù)的藥物機(jī)制的研究可以為臨床治療提供理論依據(jù)和研究方法。

圖4 ATRA對角膜上皮組織凋亡蛋白Caspase相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

A：Caspase-9、Procaspase-9表達(dá)條帶灰度值分析；B：Caspase-3、Procaspase-3表達(dá)條帶灰度值分析；1：未損傷 ATRA角膜上皮；2：未損傷 CT角膜上皮；3：角膜損傷36 h ATRA角膜上皮；4：角膜損傷36 h CT角膜上皮；與未損傷組1比較：*P<0.05；與CT組4比較：#P<0.05

圖5 ATRA對角膜上皮組織MAPK通路蛋白表達(dá)的影響

1：未損傷 ATRA角膜上皮；2：未損傷 CT角膜上皮；3：角膜損傷36 hATRA角膜上皮；4：角膜損傷36 h CT角膜上皮；與未損傷組1比較：*P<0.05；與CT組4比較：#P<0.05

已知ATRA可以改善皮膚傷口的愈合[9]。研究[10-11]表明ATRA在眼形態(tài)發(fā)生和維持角膜完整性方面起著至關(guān)重要的作用，是角膜上皮細(xì)胞增殖和分化所必需的。大量研究[12]表明ATRA可促進(jìn)角膜上皮愈合，這為ATRA用于眼科臨床試驗提供了很好的依據(jù)，但是ATRA促進(jìn)角膜損傷修復(fù)的機(jī)制目前仍未見相關(guān)報導(dǎo)。本實驗結(jié)果顯示，含0.5 mmol/L ATRA的滴眼液處理損傷后大鼠角膜，能有效促進(jìn)角膜愈合，且初步證明該過程可能與ATRA對角膜上皮損傷修復(fù)過程中細(xì)胞凋亡的調(diào)控相關(guān)，且可能與MAPK通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的改變相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是指由基因控制的細(xì)胞為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程，即細(xì)胞的程序性死亡。該過程是多基因嚴(yán)格控制，這些基因包括Caspase家族、Bcl-2家族、癌基因、抑癌基因等，且彼此種屬之間非常保守。角膜組織切片TUNEL實驗提示，0.5 mmol/L ATRA處理后角膜上皮中凋亡細(xì)胞比例明顯減少。Western blot結(jié)果顯示，在角膜上皮組織中，ATRA處理后可有效抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，同時上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-2/Bax比值顯著增高。研究[13]表明Caspases尤其是Caspases-3 受Bcl-2/Bax調(diào)控，并在凋亡的執(zhí)行中起關(guān)鍵作用。凋亡發(fā)生時，受凋亡信號刺激后，效應(yīng)Caspases對凋亡程序的進(jìn)行至關(guān)重要，然而該過程的活化需要起始Caspases對其前體進(jìn)行切割。其中Caspases-3作為效應(yīng)Caspases其活化需要上游Caspase-8、Caspases-9激活[14]。本實驗Western blot結(jié)果顯示ATRA作用下前體蛋白Procaspases-9、Procaspases-3降解明顯減少，從而抑制組織中Caspases-9表達(dá)，進(jìn)一步抑制Caspases-3表達(dá)，最終抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

MAPKs信號途徑普遍存在于多種生物細(xì)胞中，參與調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理過程。主要包括p38MAPK、c-jun N末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶3種通路。其中p38MAPK通路參與多種細(xì)胞凋亡的調(diào)控。研究[15]顯示，ATRA可通過抑制p38磷酸化水平導(dǎo)致MAPK通路的下調(diào)，從而減少心肌細(xì)胞凋亡，有效預(yù)防心肌損傷。本實驗研究結(jié)果顯示，通過ATRA處理后，上皮組織中p38的磷酸化水平降低。提示ATRA對角膜上皮組織細(xì)胞凋亡的抑制作用可能與p38磷酸化水平的降低有關(guān)。

綜上所述，在大鼠角膜上皮損傷修復(fù)過程中，ATRA對上皮愈合的促進(jìn)作用與ATRA對凋亡發(fā)生的抑制密切相關(guān)，且該作用可能與MAPK通路調(diào)控相關(guān)，通過對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Caspases-3的調(diào)控，從而抑制角膜上皮組織凋亡的發(fā)生，為深入研究角膜損傷修復(fù)的機(jī)制打下良好基礎(chǔ)，同時也為探討角膜病變的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。