張赫巖，葉冬梅，白玉娥，段國珍，彭 鵬，華佳文

（內蒙古農業(yè)大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010019）

重瓣榆葉梅Amygdalus trilobaf.multiplex，是薔薇科Rosaceae 桃屬Amygdalus的一種花灌木植物，具有開花早、花期長、花朵大、顏色鮮艷純正等特點，是一種觀賞價值很高的園林綠化樹種[1]。其株高2 ～5 m，枝條開展，具多數短小枝；短枝上的葉常簇生，一年生枝上的葉互生；嫩枝上無毛或微有被毛；葉片呈寬卵形或倒卵形。重瓣榆葉梅開花早，花重瓣且較大，花期長，花色粉紅，花型美麗，是北方地區(qū)早春觀賞價值極高的園林綠化樹種。重瓣榆葉梅的花枝細長，花型美麗，可以做插花供應材料，且現在擁有一定的市場；花粉營養(yǎng)成分豐富，含有蛋白質、氨基酸、脂肪、維生素、微量元素、生物酶、黃酮類等化合物，可用于保健食品、藥品以及營養(yǎng)性化妝品[1]。因此，重瓣榆葉梅是一種應用廣泛、具有一定經濟價值的園林綠化樹種。

目前，重瓣榆葉梅在園林綠化中備受青睞，但因雌雄蕊退化，不能正常結實獲得種子，很難滿足生產需求[2]。榆葉梅的繁殖方法較多，如播種、扦插、分株、嫁接和組織培養(yǎng)繁殖等[3-4]。但常規(guī)扦插受到各種條件限制，成活率低；分株與嫁接繁殖系數低，速度慢，致使規(guī)模繁殖受限，遠遠不能滿足市場的需求[5]。組織培養(yǎng)技術具有繁殖速度快、繁殖系數大的優(yōu)點，不受繁殖材料和季節(jié)的限制，可在短時間內獲得大量無性系[6-7]。冷肖荀等人[8]選擇重瓣榆葉梅的莖尖進行組織培養(yǎng)，結果表明6-BA 1.0 mg/L 對榆葉梅的嫩芽分化效果顯著。宋潤剛等人[5]在研究重瓣榆葉梅組織培養(yǎng)過程中，以莖尖為外植體，在培養(yǎng)過程中可以使用抗生素類物質控制雜菌污染，并且可以提高芽的增殖和分化能力。不同部位外植體的取材對重瓣榆葉梅的組織培養(yǎng)影響較大，李鳳飛[3]進行啟動培養(yǎng)時，選擇頂芽、腋芽、莖段3 種不同部位作為外植體，其中莖段的出芽率最高。但是在榆葉梅組織培養(yǎng)過程中，多數研究均存在接種外植體的褐化、接種萌芽率低等問題。因此，為解決重瓣榆葉梅繁殖系數低、接種萌芽率低和保持品種的優(yōu)良特性，本試驗采用組織培養(yǎng)對重瓣榆葉梅進行無性繁殖，以重瓣榆葉梅帶腋芽的莖段作為試驗材料，研究不同消毒方式、不同生長調節(jié)劑對重瓣榆葉梅誘導、增殖、生根的影響，以期為重瓣榆葉梅的快速繁殖提供參考依據。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

所用材料均采集于呼和浩特樹木園內，采集時間為1—4月。樹齡為3 ～5年生的重瓣榆葉梅當年生枝條或一年生枝條，剪去葉片及葉柄，截取帶有一個腋芽的莖段作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒

將試驗材料的葉片及葉柄全部剪去，使用洗潔精對帶有腋芽的莖段進行清洗，重點刷洗重瓣榆葉梅的腋芽部位。將刷洗好的莖段裝進燒杯，流水沖洗30 min。于超凈工作臺中用75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3 次，然后分別以0.1%升汞溶液（處理6、8、10、12、14 min）、2%次氯酸鈉溶液（處理6、8、10、12、14 min）進行消毒，最后使用無菌水沖洗5 次。接種于以MS 為基本培養(yǎng)基、添加IBA 0.5 mg/L 的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照強度2 000 lx ，光照14 h/d，pH值5.8 ～5.9。接種后5 d 開始統(tǒng)計外植體感染及存活情況。

1.2.2 初代培養(yǎng)

在無菌濾紙上將消毒好的莖段切去與消毒液接觸的兩端，再將莖段切成帶有一個腋芽的小段，接種于分別以MS、WPM 為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，不同質量濃度的6-BA（1.0 ～2.0 mg/L）、NAA（0.05 ～0.20 mg/L）的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強度2 000 lx，光照14 h/d，pH 值5.8 ～5.9。接種后30 d 觀察并統(tǒng)計叢生芽的生長情況。

1.2.3 繼代增殖

以初代培養(yǎng)的重瓣榆葉梅叢生芽為外植體進行增殖，以MS 為基礎培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L 以及不同質量濃度的6-BA（1.0 ～2.0 mg/L）、NAA（0.1 ～0.5 mg/L）、KT（0 ～1.0 mg/L）。培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)一致，30 d 后統(tǒng)計幼苗的增殖情況及生長狀況。

1.2.4 生根培養(yǎng)

以增殖培養(yǎng)得到的無菌苗為材料進行生根培養(yǎng)，在1/2MS 培養(yǎng)基中，添加蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L，附加不同質量濃度的NAA（0.1 ～0.3 mg/L）和IBA（0.1 ～0.3 mg/L）。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強度2 000 lx ，光照14 h/d，pH值5.7 ～5.8。20 d 后統(tǒng)計幼苗的生根和生長狀況。

1.2.5 數據統(tǒng)計

本試驗所有數據均采用Excel 軟件進行統(tǒng)計，SPSS 19.0 軟件進行結果分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對重瓣榆葉梅莖段消毒的影響

不同消毒方法對重瓣榆葉梅莖段消毒的影響見表1。

表1 不同消毒方法和時間對莖段外植體滅菌的影響?Table1 Effects of different disinfection ways and time on sterilization of stem segment explants

試驗結果表明，0.1%升汞和2%次氯酸鈉都具有一定的莖段表面滅菌效果，在一定范圍內感染率會隨著時間的增長而降低，存活率隨著時間的增長而降低。因此在篩選最佳消毒時間時，可以綜合這兩種消毒方法考慮。使用0.1%升汞對莖段進行消毒8 min 時，感染率較低，為13.30%，存活率較高，為76.7%；在14 min 時雖然感染率已經為零，但存活率較低，說明消毒時間過長會將植物細胞殺死，影響莖段生長，所以在使用0.1%升汞進行消毒時，8 min 為最佳消毒時間，效果最好。同理，使用2%次氯酸鈉消毒12 min 時，感染率較低，存活率較高，所以在使用2%次氯酸鈉進行消毒時，12 min 為最佳消毒時間。重瓣榆葉梅莖段的最佳消毒方案為：75%酒精處理30 s，然后使用0.1%升汞處理8 min 或使用2%次氯酸鈉處理12 min。圖1和圖2分別為莖段初代培養(yǎng)的生長情況。

2.2 不同激素種類與質量濃度配比對誘導芽萌發(fā)的影響

重瓣榆葉梅莖段接種后，放至培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，定期觀察側芽生長狀況，40 d 后統(tǒng)計生長情況。

在比較MS 培養(yǎng)基和WPM 培養(yǎng)基對莖段啟動培養(yǎng)的影響時發(fā)現，從啟動率、生長狀況兩方面觀察，同種質量濃度下使用MS 培養(yǎng)基比WPM 培養(yǎng)基誘導率高，生長狀況好，所以重瓣榆葉梅莖段啟動培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基（表2）。對照組C7 的莖段誘導率低于其他處理，說明添加適宜的外源激素對莖段啟動培養(yǎng)有一定作用；當添加6-BA 2.0 mg/L+0.05 mg/L NAA 時，誘導率最高，達89.30%，且生長狀況良好，利于繼代增殖。因此，對于重瓣榆葉梅莖段誘導芽萌發(fā)的啟動培養(yǎng)，最適培養(yǎng)基為MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L。

圖1 莖段初代培養(yǎng)生長良好Fig.1 Stem segments growing well in initial culture

圖2 莖段初代培養(yǎng)生長較差Fig.2 Stem segments growing poorer in initial culture

表2 不同激素配比對莖段芽誘導的影響?Table2 Effects of different hormone combinations on induction of axillary bud stem segments

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

如表3所示，不同激素質量濃度配比對重瓣榆葉梅增殖培養(yǎng)效果不同。添加 KT 1.0 mg/L，其增殖率升高，叢生芽長勢更健康，葉片呈翠綠色。平均株高以及增殖率情況比較好的處理是E1、E2、E7、E8，說明低質量濃度的NAA 可以促進叢生芽增殖及生長，質量濃度過高會對組培苗產生抑制作用（圖3、圖4）。綜合平均株高與增殖率來看，在增殖階段最適增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ KT 1.0 mg/L。

表3 不同激素配比對叢生芽增殖的影響?Table3 Effects of different hormone combinations on proliferation of axillary bud

圖3 增殖培養(yǎng)生長狀況較好Fig.3 Proliferation culture growing well

2.4 誘導生根

將增殖培養(yǎng)得到的幼苗接種在1/2MS 培養(yǎng)基中誘導根系，結果如表4所示。試驗結果表明，添加適宜的激素可以促進組培苗生根，生根率隨著IBA 和NAA 質量濃度的增加而增加，但到達一定程度后生根率會隨著激素質量濃度增加而減小。經過30 d 的培養(yǎng)，生根數目為1 ～4 條，根長為2 ～5 cm（圖5）。綜合平均根數、平均根長、生根率3 個指標來看，誘導生根最佳處理是F2，即1/2MS + IBA 0.2 mg/L。

圖4 增殖培養(yǎng)生長狀況較差Fig.4 Proliferation culture growing poor

3 討 論

外植體消毒是植物組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)之一，獲得無菌且具有生長活性的外植體是組織培養(yǎng)取得成功的重要因素[9]。在試驗過程中使外植體不經愈傷組織脫分化培養(yǎng)階段，而直接誘導分化苗，省去了誘導愈傷組織這一步，簡化了技術程序，縮短了培養(yǎng)時間，同時經這種途徑培育出的苗木能穩(wěn)定地保持母體的優(yōu)良遺傳特性[10]。通過對外植體的消毒，殺死外植體表面微生物，但是要保證盡可能減少外植體表面細胞的傷害，它的成功與否直接影響后續(xù)環(huán)節(jié)[11]。本研究發(fā)現，外植體的選擇對重瓣榆葉梅的污染率以及死亡率有一定影響，莖段較嫩在消毒時容易死亡，且腋芽生長緩慢矮??；選取半木質化的莖段，死亡率降低，且腋芽生長狀況良好，易于后期繼代增殖，這與吳玲利等[9]在白木通Akebia trifoliatavar.australis組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究相一致。因此在采集外植體時最好不要選擇當年生幼枝，選取半木質化的莖段進行組織培養(yǎng)較好。

表4 不同處理對生根培養(yǎng)的影響?Table4 Effects of different treatments on rooting culture percentage

圖5 芽在生根培養(yǎng)基中生長Fig.5 Buds growing in the rooting medium

激素的種類與質量濃度對植物的生長發(fā)育起著至為關鍵的作用[12]。在進行重瓣榆葉梅組織培養(yǎng)時，高質量濃度的激素可促進組培苗的增殖，但抑制了生長。當NAA 質量濃度較高時，重瓣榆葉梅的生長狀況較差，植株矮小且葉片小，反而較低質量濃度的NAA 會促進叢生芽增殖，長出的新芽體積變大。KT 的有無對叢生芽增殖有很好的促進作用，添加了KT，叢生芽明顯比沒有加KT 的叢生芽增殖得多，體積更大。低質量濃度的6-BA 促進重瓣榆葉梅繼代增殖，這與冼康華等[13]對文采唇柱苣苔Chirita wentsaiiD.Fang et L.Zeng的研究結果相似。

在生根培養(yǎng)時，芽基部生長出大小不均的顆粒狀愈傷組織，在此基礎上生長出根，屬于愈傷型生根。重瓣榆葉梅適宜在生長素質量濃度較低的條件生根，當IBA 或NAA 質量濃度超過0.2 mg/L時會抑制生根。

使用IBA 誘導生根的效果比NAA 更好，生根數目多，根系長，生根率高，這與孟永紅等[14]在楸樹Catalpa bungei植株再生體系研究中的結果一致。

4 結 論

本研究發(fā)現，在進行重瓣榆葉梅莖段組織培養(yǎng)時，外植體消毒先用75% 酒精處理30 s，然后用0.1% 升汞溶液消毒8 min 或2% 次氯酸鈉溶液消毒12 min，效果最好，莖段感染率較低，存活率高；在選擇初代培養(yǎng)基時，以MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L 為基本培養(yǎng)基，誘導率可達89.30%；增殖培養(yǎng)基以MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L + KT 1.0 mg/L 為最佳，增殖倍數為4.4，且生長狀況良好；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS + IBA 0.2 mg/L。