鄒雪梅 周佳偉 宋尚紅 陳冠華

摘 要 適配體是一類從隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出來的可對特定靶分子具有高親和性和特異識別性的單鏈短脫氧核糖核酸或核糖核酸序列。自從指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）的篩選方法問世以來，相繼出現(xiàn)了各種基于SELEX的改進(jìn)篩選方法，以及基于毛細(xì)管電泳分離手段的SELEX或非SELEX篩選方法。作為類似于抗體作用的分子識別元件，適配體在與食品和環(huán)境安全相關(guān)的農(nóng)獸藥殘留檢測領(lǐng)域中已得到一定的應(yīng)用。在這些應(yīng)用中，適配體通常與其它可以產(chǎn)生信號的材料如納米金、量子點(diǎn)等構(gòu)成復(fù)合探針，或與電化學(xué)電極等構(gòu)成傳感器。本文對適配體的篩選方法以及適配體在農(nóng)獸藥殘留檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了概括和總結(jié)，以期為該研究提供有益的參考。

關(guān)鍵詞 適配體; 篩選; 農(nóng)獸藥殘留; 檢測; 評述

1 引 言

食品安全和環(huán)境問題被發(fā)達(dá)國家和許多發(fā)展中國家高度重視，各國制定了嚴(yán)格的強(qiáng)制性法規(guī)來強(qiáng)化對包括農(nóng)獸藥殘留在內(nèi)的各種有害物質(zhì)的監(jiān)管。例如，美國規(guī)定在牛奶中不可檢測出抗生素殘留，歐盟限定了雞蛋中四環(huán)素類抗生素的最大殘留限量（MRL）為200 μg/kg。因此，對食品和環(huán)境樣品中農(nóng)獸藥殘留進(jìn)行有效快速檢測始終是相應(yīng)領(lǐng)域的重要研究課題。

適配體是一類從人工構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出來的單鏈短脫氧核糖核酸（ssDNA）或核糖核酸（RNA）序列，通常由20～80個堿基組成，庫中寡核苷酸序列數(shù)可達(dá)1013～1015個。適配體可以與靶分子高特異性、高親和性結(jié)合，適配體與各類靶分子的解離常數(shù)可低至nmol/L～pmol/L水平，而高特異性則體現(xiàn)為適配體可以區(qū)分僅有一個甲基區(qū)別的兩種靶分子，可被適配體識別的靶分子范圍十分廣泛，大的分子或者顆粒等包括瘧疾診斷蛋白惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（PFLDH）[1]、穿孔素蛋白[2]等蛋白質(zhì)，甚至是產(chǎn)腸毒性大腸桿菌k88[3]、金黃色葡萄球菌[4]等微生物，以及HepG2肝癌細(xì)胞[5]、AGS胃癌細(xì)胞[6]等細(xì)胞，小分子可包括一般意義上的各種小分子化合物，如雙酚A[7]、L-色氨酸[8]、黃曲霉毒素[9]等。作為一種高特異性和高親和性的分子識別元件，適配體在農(nóng)獸藥殘留的定性與定量快速檢測中得到了一些應(yīng)用，展現(xiàn)了極為廣闊的應(yīng)用前景。如何將特定靶分子的適配體從龐大的隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出來，研究者也進(jìn)行了廣泛和深入研究。本文對適配體篩選方法和適配體在農(nóng)獸藥殘留檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)行了整理和概述，為其進(jìn)一步的應(yīng)用提供一些有用的參考。

2 適配體的篩選

序列數(shù)龐大的隨機(jī)寡核苷酸文庫為篩選對各種靶標(biāo)具有高特異性識別能力和高親和性的適配體提供了基本條件，然而從序列數(shù)量達(dá)到1013～1015個的隨機(jī)文庫中將特定靶標(biāo)的適配體篩選出來絕非易事。文獻(xiàn)[10，11]分別提出了指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）的篩選方法，解決了適配體的篩選問題。在此基礎(chǔ)上，相繼出現(xiàn)了各種改進(jìn)的SELEX方法，使篩選的效率逐步得到提高。

2.1 SELEX

2.1.1 SELEX的基本步驟 SELEX主要步驟如圖1所示[12]：（1）構(gòu)建包含1013～1015個單鏈寡核苷酸隨機(jī)文庫，每個序列的兩端都含有固定的引物序列，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。篩選RNA適配體時，引物5′端需包含一段T7啟動子，以識別DNA轉(zhuǎn)錄成RNA時必需的T7RNA聚合酶，從而得到隨機(jī)RNA文庫[13]。將靶分子加入到隨機(jī)文庫中，在特定緩沖體系中進(jìn)行結(jié)合孵育;（2）充分結(jié)合后，洗脫未與靶分子結(jié)合的游離寡核苷酸，得到靶分子-寡核苷酸復(fù)合物;（3）分離與靶分子結(jié)合的核苷酸序列，洗脫和收集結(jié)合的序列;（4）以洗脫收集的核苷酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，形成富集文庫，用于下一輪的篩選循環(huán)。通常經(jīng)過6～20輪循環(huán)可篩選出高特異性、高親和力的寡核苷酸;（5）對最后富集的文庫進(jìn)行克隆和測序，以獲得最終特異性識別靶分子的適配體。在SELEX各步驟中，最關(guān)鍵的是將結(jié)合了靶標(biāo)的適配體與未結(jié)合靶標(biāo)的寡核苷酸進(jìn)行分離，有效的分離方法可以篩選到具有高親和力和高特異性的適配體。

2.1.2 硝酸纖維素膜過濾分離法 具有一定孔徑的硝酸纖維素膜可使游離的寡核苷酸序列通過，而將與靶分子結(jié)合的寡核苷酸截留，從而使其與未結(jié)合的寡核苷酸分離。通過加熱或加堿將與靶分子結(jié)合的寡核苷酸洗脫下來，再利用乙醇沉淀法回收ssDNA。Tuerk等[10]首次利用硝酸纖維素膜過濾的方法，經(jīng)過至少12輪篩選，篩選出有機(jī)染料分子和噬菌體T4DNA聚合酶的適配體。Zhu等[14]利用脫氧核糖酶可催化過氧化氫氧化3， 3′， 5， 5′-聯(lián)苯胺產(chǎn)生不溶性有色物質(zhì)，而硝酸纖維素膜能截留此有色物質(zhì)的特性，篩選出一種新型圓點(diǎn)印跡的脫氧核糖酶適配體。Wang等[15]采用此法，經(jīng)過13輪篩選獲得了針對禽流感H5N1亞型病毒HA蛋白的適配體，解離常數(shù)Kd=4.65 nmol/L。

2.1.3 親和色譜法 在瓊脂糖或葡聚糖微球中固定靶標(biāo)，將此樹脂作為固定相填充到柱中，制備親和層析柱，將隨機(jī)文庫作為流動相注入親和層析柱中孵育，作為潛在適配體的寡核苷酸將與靶標(biāo)發(fā)生親和作用而結(jié)合在固定相上，用結(jié)合緩沖液沖洗掉未結(jié)合序列，然后用洗脫緩沖液洗脫結(jié)合在親和柱上的寡核苷酸，得到適配體。利用此法已篩選出多種小分子適配體，如有機(jī)磷[16]、啶蟲脒[17]和卡那霉素[18]等。其中卡那霉素適配體篩選是使用溴化氰活化瓊脂糖柱固定的靶標(biāo)，經(jīng)9輪篩選后得到適配體，Kd=78.8 nmol/L。

2.1.4 磁珠法 將靶標(biāo)固定于磁珠上，使隨機(jī)文庫與靶標(biāo)磁珠混合孵育，親和反應(yīng)后外加磁場，去除含未結(jié)合寡核苷酸的上清液，得到靶標(biāo)磁珠-ssDNA的復(fù)合物。此法只需少量靶分子，操作簡單，分離方便。Mehta等[19]采用氯霉素包被的磁珠，經(jīng)過8輪篩選，從ssDNA文庫中篩選出兩個親和力較高的氯霉素DNA適配體7號和16號，適配體中G堿基的含量大于35%。此次得到的DNA適配體比以前的RNA適配體具有更高親和力。用熒光法測定的Kd值分別為0.766 μmol/L和1.16 μmol/L。Kiani等[20]利用生物素與鏈霉親和素的高親和特性將生物素?；牡馗咝涟挥阪溍褂H和素修飾的磁珠上，經(jīng)過11輪篩選，得到地高辛的DNA適配體，Kd=8.2 nmol/L。

2.2 改進(jìn)的SELEX

2.2.1 熒光磁珠SELEX 將靶分子固定在磁珠上，與隨機(jī)文庫混合孵育，利用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行定量的PCR擴(kuò)增，通過觀測熒光可實(shí)時監(jiān)測結(jié)合到靶分子上的適配體的量，提高了篩選效率。孫美琪等[21]利用此法，將氯胺酮固定在修飾甲苯磺?；拇胖樯?，經(jīng)過13輪篩選得到能特異性識別氯胺酮的兩條DNA適配體，并利用熒光強(qiáng)度測得Kd值分別為0.59 μmol/L和0.66 μmol/L。

2.2.2 加尾SELEX 設(shè)計并合成組合文庫，庫中每個分子兩端分別是4個堿基和6個堿基的固定序列。當(dāng)對本輪篩選出來的序列進(jìn)行擴(kuò)增時，通過架橋序列使文庫與引物片段連接，然后以橋接上去的片段為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的引物部分。可以通過堿裂解除去，從而使進(jìn)入下輪篩選的仍是兩端為短固定序列的次級文庫。此法可以直接篩選出不含兩端引物結(jié)合部位的適配體，無需進(jìn)一步的引物截短處理。Vater等[22]利用該方法篩選出降鈣素基因短肽的適配體。

2.2.3 消減SELEX 消減篩選（Substraction）可篩選出能夠區(qū)分同源靶分子的特異性適配體。先用靶標(biāo)以外的物質(zhì)進(jìn)行消減篩選，從隨機(jī)文庫中扣除可能的非特異性適配體，再用靶標(biāo)對剩余部分進(jìn)行篩選，得到高特異性的適配體。Wang等[23]采用此方法以非分化的PC12細(xì)胞為消減細(xì)胞，經(jīng)過6輪篩選，得到了已分化的PC12的適配體。葸玉琴等利用此方法，以HIV gp41抗原作為消減抗原，經(jīng)過6輪篩選，得到了3條HIV P24抗原的特異性適配體[24]。

2.2.4 切換SELEX 切換篩選可以篩選出對多種靶標(biāo)都可以識別的適配體。通常要求多個靶標(biāo)具有共同的結(jié)構(gòu)域，篩選循環(huán)要根據(jù)不同的靶標(biāo)進(jìn)行策略的切換。White等[25]在篩選可識別人凝血酶和豬凝血酶的適配體時就采用了切換篩選的方法。在第一次篩選中同時使用人凝血酶和豬凝血酶兩種靶標(biāo)，之后的篩選依次交替使用人凝血酶和豬凝血酶，經(jīng)過13輪篩選，得到一組對人凝血酶和豬凝血酶均具有親和力的RNA適配體。Song等[26]將切換篩選與細(xì)胞篩選相結(jié)合，篩選出對大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、枯草桿菌以及表皮葡萄球菌均有親和力的適配體，此實(shí)驗(yàn)表明了從隨機(jī)文庫中分離出對不同屬的細(xì)菌均具有親和性的適配體的可能性。

2.2.5 鏡像SELEX 鏡像篩選利用手性分子具有旋光性的特點(diǎn)，從D-核酸文庫中篩選出靶標(biāo)旋光異構(gòu)體的適配體，將篩選出的適配體合成為L-核酸，即為靶標(biāo)的適配體，獲得的左旋結(jié)構(gòu)的適配體不易被核糖核酸酶識別，具有高穩(wěn)定性。Maasch等[27]以高遷移率族蛋白A1為靶標(biāo)，采用此方法篩選出其特異性鏡像適配體NOX-A50，其解離常數(shù)Kd為7 nmol/L。

2.2.6 基因組SELEX 基因組篩選是將某生物的整個基因組作為寡核苷酸文庫，將生物活性分子，如蛋白質(zhì)、多糖、抗生素等作為靶標(biāo)，從文庫中篩選靶標(biāo)的天然識別序列。此基因組文庫需要包含全部的基因序列和全部的內(nèi)含子序列。Shimada等[28]用此方法識別了大腸桿菌基因組中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活因子YbaO的物質(zhì)-YbaOM操縱子，YbaOM操縱子與半胱氨酸降解有關(guān)。

2.2.7 細(xì)胞SELEX 細(xì)胞篩選是一種以完整的細(xì)胞作為靶標(biāo)的篩選方法[29]。在靶標(biāo)與隨機(jī)文庫混合孵育后，孵育液被離心處理。如果棄上清液中游離的核酸，則屬于正向篩選方法。后續(xù)步驟是對沉淀中的核酸-菌體復(fù)合物進(jìn)行變性，使細(xì)胞或菌體與核酸分離，通過離心回收上清液，并對上清液中的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 作為下一輪篩選所用的次級文庫。Duan等[31]利用此法，分別經(jīng)過9輪篩選，得到副溶血性弧菌的適配體[30]和鼠傷寒沙門氏菌適配體。如果收集上清液中未結(jié)合的核酸作為次級文庫， 再與靶標(biāo)孵育，則屬于反向篩選的方法，后續(xù)對經(jīng)多輪篩選后的最后一輪沉淀進(jìn)行變性處理，離心洗脫后獲得的核酸即為該細(xì)胞的適配體[32]，陳鑫等[33]采用此方法，以急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4為靶標(biāo)，經(jīng)過16輪篩選，得到了其3種特異性適配體，其中CX9序列結(jié)合率最高（17.2%）， Kd=16.2 nmol/L。

2.2.8 基于毛細(xì)管電泳（CE）的SELEX 2004年，Mendonsa等[34]將CE結(jié)合到SELEX中，CE具有的高效分離選擇性特點(diǎn)使篩選的效率大大提高，一般僅需2～4輪即可達(dá)到SELEX 8-15輪的富集效率。他們以免疫球蛋白E（IgE）為靶標(biāo)檢驗(yàn)了此方法的能力。因寡核苷酸文庫與靶蛋白IgE荷質(zhì)比不同，結(jié)合后的寡核苷酸序列與游離文庫間在自由溶液中存在淌度差別，利用CE可實(shí)現(xiàn)其分離，通過僅兩輪篩選即可得到解離常數(shù)低至40 nmol/L的IgE適配體。與親和層析中使用支持物不同，在使用CE的SELEX中，文庫與靶分子的結(jié)合完全在溶液中進(jìn)行，結(jié)合靶分子的序列與未結(jié)合靶分子的序列經(jīng)CE分離后分別收集，不需要洗脫步驟，避免了固定相與連接臂引入的弊端，非特異性吸附大大降低，消除了動力學(xué)方面的缺陷[35]。由于大分子靶標(biāo)與適配體結(jié)合后的荷質(zhì)比與游離文庫之間的淌度差明顯，易于CE的分離，因此CE-SELEX篩選適配體的研究主要集中于蛋白等大分子靶標(biāo)[36，37]。研究者也采用CE-SELEX篩選小分子靶標(biāo)的適配體 [38，39]，Yang等[40]采用此方法經(jīng)3輪篩選，獲得小分子目標(biāo)N-甲基-卟啉的8個DNA適配體，其中有2個可以催化卟啉的金屬嵌入式反應(yīng)。一般而言，采用基于CE的SELEX篩選小分子物質(zhì)的適配體存在一定困難[41]。對CE-SELEX進(jìn)行細(xì)分有幾種方法。（1）平衡混合物的非平衡毛細(xì)管電泳（NECEEM） 將寡核苷酸文庫與靶分子共同孵化，當(dāng)二者達(dá)到平衡時，將混合物注入到毛細(xì)管中，在CE的高壓電場中，靶標(biāo)、核酸及靶標(biāo)-核酸復(fù)合物根據(jù)淌度差異分離。在分離過程中，復(fù)合物不斷解離，解離區(qū)域在CE分離時間段內(nèi)表現(xiàn)為靶標(biāo)（核酸）的拖尾或前伸峰，拖尾或前伸峰形與解離速率常數(shù)（Koff）呈指數(shù)關(guān)系。因此，在CE過程中可求出結(jié)合/解離平衡常數(shù)和速率常數(shù)（Kd， Koff和Kon）[42]。Krtlov等[43]研究了溫度對Taq DNA聚合酶適配體的熱化學(xué)反應(yīng)影響，結(jié)果顯示，溫度變化會使適配體構(gòu)型發(fā)生變化，進(jìn)一步給出熱力學(xué)結(jié)合參數(shù)焓變和熵變。NECEEM拓展了毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式應(yīng)用的范圍，適用于研究任何從弱到強(qiáng)的相互作用體系，是一種基于分離相關(guān)性的方法。此方法經(jīng)1～3輪即可篩選出一個適配體，使篩選時間由SELEX的2～4周縮短為1天，而且還能同時測得適配體對靶分子的Kd值。該方法目前的應(yīng)用報道主要集中于一些大分子蛋白適配體的篩選[36， 42]。Berezovski等[42]利用此法，經(jīng)1輪循環(huán)即篩選出親和力為1 nmol/L的PFTase的適配體。（2）平衡混合物的平衡毛細(xì)管電泳（ECEEM） 與NECEEM的原理基本相同，區(qū)別在于ECEEM的電泳運(yùn)行緩沖液中有靶分子，且其濃度與平衡混合物中靶分子的濃度相同，在電泳過程中可以保持靶分子-適配體復(fù)合物的動態(tài)平衡。利用ECEEM可篩選到對靶標(biāo)具有預(yù)設(shè)親和強(qiáng)度的適配體[44]，還可以對篩選出的適配體克隆的親和力進(jìn)行快速評價[45]。（3）微型自由流電泳（μFFE） 在μFFE裝置中，樣品和緩沖液被各自的泵攜帶流入一個混合槽，在與緩沖液流動方向相垂直的方向施加電場，不同淌度的物質(zhì)沿橫向分開，在緩沖液流動方向橫截面上的不同位置存在淌度不同的物質(zhì)[46]。 Jing等[47]利用此裝置建立了一種適配體CE篩選新形式，可以連續(xù)應(yīng)用、分離、收集寡核苷酸文庫。將100 μmol/L羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的隨機(jī)文庫與10 nmol/L IgE在由tris-甘氨酸-磷酸二氫鉀組成的結(jié)合緩沖液中室溫下孵育20 min，隨后將混合物注入μFFE裝置中，再注入分離緩沖液，施加電場后，在電滲流的作用下未結(jié)合的ssDNA與適配體-IgE復(fù)合物分離，收集結(jié)合序列，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測，檢測區(qū)位于進(jìn)樣孔下方1.5 cm處的分離區(qū)域，在檢測區(qū)利用相機(jī)通過顯微鏡記錄每秒內(nèi)未結(jié)合的ssDNA與適配體-IgE復(fù)合物的熒光圖像。利用此方法成功篩選出了人IgE的適配體。此方法樣品需求量小，收集裝置簡單，收集量大，污染或非特異性擴(kuò)增的可能性低;而且用時少，施加的電場低，復(fù)合物解離的風(fēng)險低;篩選速度快，單輪篩選就可以得到nmol/L級的適配體。但是這一方法需要特殊的μFFE裝置，不利于推廣。（4）毛細(xì)管電泳分區(qū)收集SELEX（FCE-SELEX） FCE-SELEX方法是在NECEEM模式的基礎(chǔ)上，在靶標(biāo)電泳峰和文庫電泳峰之間，將適配體收集窗口劃分為多段，將每段收集到單獨(dú)的PCR管中，PCR管中裝有油封的PCR混合物。采用這種油封的方法來分區(qū)收集，確保復(fù)合物的高效分離和收集，避免了PCR擴(kuò)增過程中的污染。Luo等[48]采用此種方法，通過一輪篩選就得到了可與鏈霉親和素結(jié)合的適配體，并通過表面等離子體共振（SPR）方法測得適配體SBA-36對鏈霉親和素的親和力為30.8 nmol/L。

2.3 非SELEX（non-SELEX）方法

Berezovski等[49]在NECEEM模式的基礎(chǔ)上，提出了省卻多次PCR擴(kuò)增步驟的non-SELEX方法，上一輪分離后的非游離文庫直接進(jìn)入下一輪篩選過程，只需要對最后一次產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，簡化了篩選過程，得到親和力增強(qiáng)的收斂文庫。此技術(shù)能使寡核苷酸文庫對靶標(biāo)的親和力提高4個數(shù)量級。Non-SELEX最顯著的優(yōu)點(diǎn)是可用于那些不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增的文庫。Ashley等[50]利用non-SELEX篩選出解離常數(shù)為微摩爾級別的牛過氧化氫酶適配體，Tok等[36]利用該方法篩選出信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Cdc42-GTP、PAK1和MRCK的適配體。

3 適配體在農(nóng)獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

核酸適配體與傳統(tǒng)抗體一樣具有對特定靶標(biāo)的識別能力，但其本身并不直接產(chǎn)生檢測信號。因此，在農(nóng)獸藥殘留檢測方法中，適配體通常與其它可以產(chǎn)生信號的材料（如納米金（AuNPs）、量子點(diǎn)等）構(gòu)成復(fù)合探針，或與電化學(xué)電極等構(gòu)成傳感器的方式進(jìn)行檢測，其靈敏度能達(dá)到nmol/L～pmol/L， 甚至fmol/L級[51]，為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留的快速檢測提供了新的解決方案。

3.1 適配體在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

早期的抗生素適配體研究主要是針對抗生素的RNA適配體，但是RNA不穩(wěn)定，并不適用于抗生素殘留檢測分析，于是又逐漸篩選得到了抗生素的ssDNA適配體，并建立了多種方法用于抗生素的檢測分析。

3.1.1 適配體在四環(huán)素類抗生素殘留檢測中的應(yīng)用 Guo等[52]通過電沉積法將AuNPs固定在玻碳電極（GCE）表面，形成沉積金（DpAu）/GCE，再將四環(huán)素的適配體通過與AuNPs的配位作用結(jié)合在DpAu/GCE上，然后再在電極表面滴加亞甲基藍(lán)（MB），形成MB/適配體/DpAu/GCE傳感器。當(dāng)加入與適配體親和性更強(qiáng)的四環(huán)素時，其與MB對適配體的競爭結(jié)合使MB釋放，電流值變小，通過電流的變化檢測四環(huán)素的濃度（圖2）。Zhang等[53]在檢測牛奶中的四環(huán)素時，采用了同樣的策略，在5 min內(nèi)即可完成牛奶中四環(huán)素殘留的檢測。

Kim等[54]將生物素化的ssDNA適配體固定在鏈霉親和素修飾的網(wǎng)狀金電極上，構(gòu)建了四環(huán)素電化學(xué)生物傳感器，采用循環(huán)伏安法（CV）和方波伏安法（SWV）分析適配體與四環(huán)素間的結(jié)合作用，該適配體對四環(huán)素有良好的特異性。Kim等[55]將適配體電化學(xué)傳感器用于檢測土霉素，在金電極芯片上以硫醇修飾的適配體素，通過CV和SWV檢測適配體與目標(biāo)分子間作用產(chǎn)生的電化學(xué)信號。

3.1.2 適配體在氨基糖苷類抗生素殘留檢測中的應(yīng)用 Song等[18]利用SELEX篩選到一個卡那霉素的ssDNA適配體Ky2，對卡那霉素、卡那霉素B和妥布霉素的解離常數(shù)分別為78.8、84.5和103 nmol/L。利用該適配體建立了卡那霉素的AuNPs比色分析法，其測定原理如圖3所示。AuNPs與適配體通過配位作用結(jié)合，適配體可使其在BaCl2溶液中保持分散狀態(tài)。當(dāng)加入卡那霉素時，適配體構(gòu)象變化，從AuNPs解離下來，失去適配體保護(hù)的AuNPs發(fā)生鹽誘導(dǎo)聚集，顏色從分散態(tài)紅色變化為紫色?？敲顾貪舛扰c620 和520 nm的吸光度比率A620/A520有關(guān)，卡那霉素濃度越高，比率越大。

Zhou等[56]將5′修飾巰基的卡那霉素適配體通過自組裝方式連接到金電極表面，構(gòu)建電化學(xué)傳感器?？敲顾睾笈c適配體的結(jié)合使金電極表面覆蓋率增加，阻礙電子傳遞，利用差分脈沖伏安法進(jìn)行卡那霉素的測定。

de-los-Santos-lvarez等[57]利用甲基修飾的RNA適配體，結(jié)合SPR技術(shù)建立了競爭結(jié)合檢測新霉素B的方法。將新霉素B固定在SPR傳感器上，當(dāng)加入新霉素B的適配體時，適配體與新霉素B作用，構(gòu)象改變，使SPR信號變化，在低濃度條件下，隨著適配體濃度的增加，角位移凈改變量線性增大。當(dāng)SPR傳感器檢測含有固定濃度適配體的樣品時，樣品中新霉素B將與固定于傳感器上的新霉素B競爭結(jié)合適配體， 產(chǎn)生的SPR角位移凈改變量信號隨樣品中新霉素B濃度升高而降低。

3.1.3 適配體在氯霉素類抗生素殘留檢測中的應(yīng)用 Pilehvar等[58]建立了一種基于適配體電化學(xué)生物傳感器檢測氯霉素的方法。適配體通過自組裝固定在金電極表面，當(dāng)存在氯霉素時，電極表面的適配體變?yōu)榘l(fā)夾結(jié)構(gòu)，使靶標(biāo)接近電極，引發(fā)電子轉(zhuǎn)移。此方法被成功用于牛奶樣品中氯霉素的檢測。高慧菊等[59]利用適配體對靶標(biāo)的特異性和氧化鈀納米顆粒（PdO）標(biāo)記聚合酶螯合物（EV）的雙重信號放大效應(yīng)，構(gòu)建了一種氯霉素適配體傳感器。他們將PdO與EV和互補(bǔ)DNA（cDNA）結(jié)合，組成信號探針cDNA-PdO-EV，同時將膠體金納米顆粒與納米磁珠、適配體結(jié)合為捕獲探針偶聯(lián)物，將捕獲探針與信號探針雜交形成復(fù)合物，制得適配體傳感器。檢測氯霉素時，由于氯霉素與適配體間的特異識別性，使雜交復(fù)合物中的互補(bǔ)DNA與適配體解鏈，通過磁分離使信號探針留在上清液中，信號探針中的EV含有辣根過氧化物酶（HRP），HRP能夠催化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）發(fā)生顏色變化，同時PdO也能催化TMB變?yōu)樗{(lán)綠色，根據(jù)TMB在652 nm處的吸光度對氯霉素進(jìn)行定量分析，并成功用于魚肉和鵝肉樣品的檢測。

3.1.4 適配體在蒽環(huán)類抗生素殘留檢測中的應(yīng)用 Chandra等[60]將磷脂酰絲氨酸（PS）和適配體作為生物識別分子，共同固定到AuNPs修飾的2， 2′，5′， 2′-三噻吩-3′-對芐磺酰胺基苯甲酸（polyTTBA）導(dǎo)電聚合物上，形成GCE/AuNPs/polyTTBA/PS-適配體/AuNPs傳感器，利用電化學(xué)方法檢測柔紅霉素，電極捕獲的柔紅霉素越多，用CV掃描得到的電流越大。該方法具有很好的穩(wěn)定性，已成功用于尿液樣本中的柔紅霉素的分析。

3.1.5 適配體在β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測中的應(yīng)用 Song等[61]以SELEX方法篩選氨芐青霉素的適配體，得到3個親和性較高的適配體AMP4、AMP17和AMP18，解離常數(shù)分別為9.4、13.4和9.8 nmol/L。 他們將修飾FAM的適配體作為雙探針，建立了基于AuNPs熒光和AuNPs比色檢測牛奶中氨芐青霉素的方法。AuNPs可通過配位作用與FAM標(biāo)記的適配體結(jié)合，使FAM的熒光猝滅，當(dāng)加入氨芐青霉素時，適配體因與其結(jié)合而構(gòu)象改變，并與AuNPs解離，F(xiàn)AM熒光得以恢復(fù)，通過檢測FAM熒光強(qiáng)度從而測定氨芐青霉素濃度。如果向與FAM-適配體配位結(jié)合的AuNPs和氨芐青霉素的混合物中加入NaCl溶液時，適配體同樣因與氨芐青霉素結(jié)合而構(gòu)象改變，沒有適配體保護(hù)的AuNPs因鹽聚而顏色由分散態(tài)的紅色變?yōu)榫奂瘧B(tài)的紫色，通過測定A520/A620的變化檢測氨芐青霉素。

3.1.6 適配體在磺胺類抗生素殘留檢測中的應(yīng)用 Yan等[62]同樣利用適配體和AuNPs的配位結(jié)合特性，建立了一種檢測磺胺二甲氧嘧啶的比色檢測法，方法利用的是AuNPs具有類似過氧化物酶活性的特點(diǎn)。當(dāng)向適配體修飾的AuNPs溶液中加入樣品時，適配體與樣品中磺胺二甲氧嘧啶結(jié)合使其從AuNPs上脫離，AuNPs由此恢復(fù)了催化活性，可以催化溶液中的底物TMB與過氧化氫的氧化反應(yīng)，顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色。通過測定650 nm處的吸光度測定磺胺二甲氧嘧啶的濃度，方法檢出限低于MRL規(guī)定的100 ng/mL。

3.1.7 適配體在激素類藥物殘留檢測中的應(yīng)用 Liu等[63]利用AuNPs比色法實(shí)現(xiàn)了對17α-雌二醇的檢測。他們研究了適配體的鏈長度對檢測的影響，將17β-雌二醇76個堿基的適配體劈裂成兩個片段P1和P2，分別含33和44個堿基，P1和P2的混合物在1 μmol/L濃度下就可達(dá)到原適配體1.5 μmol/L濃度防止AuNPs聚集的作用。因此，使用P1和P2混合物修飾AuNPs可以使靶標(biāo)在濃度較低時就能引起AuNPs溶液顏色改變，劈裂的適配體可以使檢測靈敏度提高10倍。

3.2 適配體在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

3.2.1 適配體在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用 Wang等[16]以4種有機(jī)磷混合物（甲拌磷，丙溴磷，水胺硫磷，氧樂果）為靶標(biāo)，經(jīng)12輪SELEX篩選后得到2個親和力較高的適配體SS2-55和SS4-54，4種有機(jī)磷的Kd為0.8～2.5 μmol/L。他們設(shè)計了5′-FAM-CTGCACAAGAATCGCTGCAG-DABCYL-3′作為分子信標(biāo)，該信標(biāo)與篩選出的適配體中間的核苷酸固定序列部分互補(bǔ)，分子信標(biāo)的背景熒光強(qiáng)度較低，當(dāng)其與適配體結(jié)合時，熒光增強(qiáng)，樣品中的有機(jī)磷競爭結(jié)合適配體時，分子信標(biāo)將與適配體解離，熒光強(qiáng)度與之前相比有所降低，降低程度與加入的有機(jī)磷濃度呈正相關(guān)，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對有機(jī)磷的定量分析。Zhang等[64]利用分子信標(biāo)與適配體建立了對同樣4種有機(jī)磷農(nóng)藥的熒光檢測方法，并成功用于甘藍(lán)樣品的檢測。Pang等[65]在檢測同樣的4種有機(jī)磷農(nóng)藥時采用了一種將適配體的選擇性識別作用與表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）檢測相結(jié)合的檢測方法。巰基化的適配體通過Ag-S鍵被偶聯(lián)在銀枝晶表面，所得到的銀枝晶-適配體偶聯(lián)物作為SERS基底，用于蘋果汁中4種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測，此方法不僅能夠?qū)@4種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定量分析，而且可以進(jìn)行定性分析。Tang等[66]在檢測這4種有機(jī)磷農(nóng)藥時，將適配體的互補(bǔ)序列（AMO）與羧基化修飾的CdTe/CdS核-殼型量子點(diǎn)（QD）偶聯(lián)，此AMO-QD復(fù)合物可與適配體通過雜交反應(yīng)繼續(xù)偶聯(lián)為AMO-QD-適配體復(fù)合物。當(dāng)加入靶標(biāo)有機(jī)磷后，適配體與有機(jī)磷的高親和力使其從AMO-QD-適配體復(fù)合物上解離。利用CE對AMO-QD和過量的AMO-QD-適配體進(jìn)行分離，并對分離后的兩部分進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。AMO-QD與AMO-QD-適配體的熒光強(qiáng)度比值隨有機(jī)磷濃度的變化而變化，據(jù)此可進(jìn)行定量分析，并成功用于蘋果皮中這4種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測。

在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測應(yīng)用中，很多研究者采用與文獻(xiàn)[18]原理相同的AuNPs比色法，實(shí)現(xiàn)了對包括大米樣品中的異稻瘟凈和克瘟散的檢測[67]， 以及環(huán)境水中水胺硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敵百蟲和伏殺硫磷的檢測[68]。

3.2.2 適配體在新煙堿類農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用 Fan等[69]構(gòu)建了檢測啶蟲脒殘留的一種將適配體電化學(xué)傳感器。他們通過CV將50 nm 的AuNPs電沉積在裸金電極表面，形成具有更大表面積的AuNPs/金電極，AuNPs可與巰基化啶蟲脒適配體通過Au-S鍵連接，形成高選擇性的適配體/AuNPs/金電極，檢測含有啶蟲脒的樣品時，適配體識別啶蟲脒，在電極表面形成啶蟲脒-適配體復(fù)合物，電子傳遞阻抗增加。啶蟲脒-適配體復(fù)合物的解離常數(shù)Kd=23.41 nmol/L，適配體傳感器對啶蟲脒具有高特異性，吡蟲啉、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、莠去津、氧樂果、毒死蜱和敵百蟲基本不干擾測定。此方法用于廢水和西紅柿樣品的檢測。Shi等[70]對啶蟲脒的檢測則是采用了適配體AuNPs比色法，原理與文獻(xiàn)[18]相同，已用于土壤的檢測。Lin等[71]采用的方法則是將ZnS：Mn QD與啶蟲脒的適配體結(jié)合，利用適配體芳核堿基與多壁碳納米管（MWCNT）上C的sp2雜化軌道間的π-π堆積相互作用， 使適配體-QD固定在MWCNT上。QD和MWCNT可構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）系統(tǒng)，作為能量供體的QD被310 nm光激發(fā)后，其激發(fā)能可迅速被能量受體MWCNT吸收， QD不發(fā)射熒光。當(dāng)加入啶蟲脒時，啶蟲脒與適配體的高親和性結(jié)合可破壞適配體-QD與MWCNT的相互作用，QD在580 nm處的熒光得以恢復(fù)，熒光恢復(fù)程度與啶蟲脒的濃度呈正相關(guān)。此法已成功用于河水和大白菜樣品的檢測。