李玉輝 陸麗娟 王磊 張曉茹 胡萬(wàn)寧 李玉鳳

神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤。2016 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）在2007 版基礎(chǔ)上對(duì)膠質(zhì)瘤的分類與分級(jí)進(jìn)行了修訂和完善。根據(jù)惡性程度將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)4 個(gè)病理等級(jí)，病理等級(jí)越高，膠質(zhì)瘤的惡性程度越高[1]。分子亞型的引入能更客觀地以生物學(xué)同質(zhì)性精準(zhǔn)定義腫瘤類型[1]。膠質(zhì)瘤是由先天的遺傳高危因素和環(huán)境的致癌因素相互作用所致。表觀遺傳調(diào)控是遺傳與環(huán)境相互作用的重要紐帶，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視[2]。闡明膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的表觀遺傳機(jī)制有利于全面地認(rèn)知膠質(zhì)瘤。

泛素樣含PHD 和環(huán)指域蛋白1（ubiquitin-like con-taining PHD ring finger 1，UHRF1）是一個(gè)重要的表觀遺傳調(diào)控因子，參與調(diào)控DNA 甲基化修飾，是近些年腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[3]。正常細(xì)胞中UHRF1表達(dá)具有周期差異性特點(diǎn)，在靜止的細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或者低表達(dá)，但在增殖的細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)，促進(jìn)G1期向S 期轉(zhuǎn)換[4]。而UHRF1 在腫瘤細(xì)胞的任何細(xì)胞周期中均為高表達(dá)，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖以及基因組DNA 甲基化異常的重要因素之一[3]。

蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡是蛋白發(fā)揮正常生物學(xué)功能的重要條件，泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白1（βtransducin repeat-containing protein 1，β-TrCP1）是一種E3 泛素連接酶，介導(dǎo)多種底物蛋白泛素化，繼而被蛋白酶體所降解[5]。皰疹病毒相關(guān)性泛素特異性蛋白酶（herpes associated ubiquitin specific proteas，HAUSP）是泛素酶家族成員之一，能水解底物蛋白與泛素化鏈之間的鏈接，抑制蛋白降解，從而增加蛋白的穩(wěn)定性[6]。β-TrCP1 和HAUSP 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視[5-6]。不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中β-TrCP1、UHRF1 及HAUSP 三種蛋白表達(dá)的相關(guān)性及與臨床病理特征的相關(guān)性尚不明確。本研究旨在通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法分析DNA 甲基化調(diào)控因子UHRF1 及泛素化酶β-TrCP1 和去泛素化酶HAUSP 在不同分級(jí)的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異，以及β-TrCP1、UHRF1 和HAUSP 與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的相關(guān)性，以期為闡明膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供表觀遺傳基礎(chǔ)依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取唐山市人民醫(yī)院病理科自2011 年6 月至2015 年5 月經(jīng)外科手術(shù)切除、石蠟包埋的膠質(zhì)瘤組織84 例，所取組織的膠質(zhì)瘤患者病例資料完整。全部蠟塊標(biāo)本均由2 名病理科醫(yī)生通過(guò)鏡下檢測(cè)確認(rèn)其病理診斷。本研究程序經(jīng)唐山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，標(biāo)本采集均與患者家屬簽署知情同意書。

二、主要試劑

β-TrCP1 抗體（RD 公司，美國(guó)），UHRF1 抗體（SAB 公司，美國(guó)），HAUSP 抗體（SANTA 公司，美國(guó)），免疫組織化學(xué)染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)公司），3,3-二氨基聯(lián)苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB）顯色劑（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

三、免疫組織化學(xué)染色

所有病理切片均采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法染色，石蠟切片置于56℃烤箱烤片50 min，二甲苯脫蠟，3%H2O2溶液阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物，枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)，5%牛血清白蛋白溶液封閉，一抗4℃過(guò)夜（β-TrCP1抗體1∶33 稀釋；UHRF1 抗體1∶200 稀釋；HAUSP 抗體1∶100 稀釋；PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照），室溫復(fù)溫30 min，二抗采用二步法免疫組織化學(xué)染色試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，樹脂封片。

免疫組織化學(xué)分析結(jié)果評(píng)估采用染色比例評(píng)分（proportion score，PS）和染色強(qiáng)度評(píng)分（intensity score，IS）二級(jí)計(jì)分法[7]。PS 基于陽(yáng)性染色范圍的比例：無(wú)顯色為0 分；＜1%為1 分；1%～10%為2 分；10%～33.3%為3 分；33.3%～66.7%為4 分；＞66.7%為5 分。IS 基于陽(yáng)性的平均染色強(qiáng)度：無(wú)顯色為0 分；淡黃色為1 分；黃或者深黃色為2 分；褐或者深褐色為3分。采用Allred 評(píng)分系統(tǒng)（Allred score=PS+IS）作為免疫組織化學(xué)的半定量評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，總分8 分，1～8 分的定義為陽(yáng)性（+），0 分的定義為陰性（-）[7]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。3 種蛋白陽(yáng)性率和陰性率用率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析法分析膠質(zhì)瘤組織中2 種蛋白的相關(guān)性。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、β-TrCP1、UHRF1 和HAUSP 蛋白在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)情況

84 例Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，表觀遺傳因子UHRF1、泛素化酶β-TrCP1和去泛素化酶HAUSP 在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中均表達(dá)，3 種蛋白均主要定位于細(xì)胞核（圖1）。

圖1 β-TrCP1、UHRF1 和HAUSP 蛋白在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×600）

二、UHRF1、β-TrCP1 和HAUSP 蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的相關(guān)性分析

UHRF1、β-TrCP1 和HAUSP 蛋白陽(yáng)性率均與膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）。3 種蛋白陽(yáng)性率均與膠質(zhì)瘤患者的WHO 病理分級(jí)有關(guān)，UHRF1和HAUSP 蛋白陽(yáng)性率隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增高而增高（P=0.005、0.002），而β-TrCP1 的蛋白陽(yáng)性率隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增高而降低（P=0.003）。具體信息見表1。

三、膠質(zhì)瘤組織中UHRF1 表達(dá)與β-TrCP1、HAUSP表達(dá)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中，UHRF1 的Allred 評(píng)分均與β-TrCP1 的Allred 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（Ⅰ級(jí)：r=-0.903，P=0.000；Ⅱ級(jí)：r=-0.930，P=0.000；Ⅲ級(jí)：r=-0.895，P=0.000；Ⅳ級(jí)：r=-0.920，P=0.000）（圖2）。另一方面，在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中，UHRF1 的Allred 評(píng)分均與HAUSP 的Allred 評(píng)分呈正相關(guān)（Ⅰ級(jí)：r=0.931，P=0.000；Ⅱ級(jí)：r=0.866，P=0.000；Ⅲ級(jí)：r=0.803，P=0.000；Ⅳ級(jí)：r=0.904，P=0.000）（圖3）。

討論

表觀遺傳因素在膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[2]。UHRF1 作為重要的表觀遺傳調(diào)控因子，其在膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中的表達(dá)水平與臨床病例特征的關(guān)系以及其異常蛋白水平的維持機(jī)制受到關(guān)注。

表1 UHRF1、β-TrCP1 和HAUSP 蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床參數(shù)的關(guān)系[例（%）]

圖2 在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中UHRF1 和β-TrCP1 的相關(guān)性分析

圖3 在Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中UHRF1 和HAUSP 的相關(guān)性分析

本研究發(fā)現(xiàn)UHRF1 蛋白陽(yáng)性率隨著膠質(zhì)瘤WHO 級(jí)別增高而增高。Oba-Shinjo 等[8]分析UHRF1在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)高于低級(jí)別星形細(xì)胞瘤，與本研究結(jié)果一致。已有研究發(fā)現(xiàn)UHRF1 在膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞內(nèi)皆高表達(dá)[9]。UHRF1 的表達(dá)與胃癌分化程度、TNM 分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且提示患者預(yù)后不良。這些研究成果均提示UHRF1 在不同組織腫瘤中均發(fā)揮促癌作用[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)泛素化酶β-TrCP1 蛋白陽(yáng)性率隨著膠質(zhì)瘤WHO 級(jí)別增高而降低。Liang 等[11]發(fā)現(xiàn)β-TrCP1 蛋白表達(dá)在正常腦組織中呈高表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平低于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，表達(dá)水平越低，膠質(zhì)瘤預(yù)后越差，與本研究結(jié)果一致。此外，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中β-TrCP1 與UHRF1 呈負(fù)相關(guān)，因此筆者推測(cè)膠質(zhì)瘤中UHRF1 蛋白可能是β-TrCP1 的泛素化底物，β-TrCP1 呈低表達(dá)導(dǎo)致UHRF1 蓄積引起表觀修飾的異常，可能是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的因素之一。有報(bào)道顯示結(jié)直腸癌組織中β-TrCP1 呈高表達(dá)[12]。結(jié)合胃癌和膠質(zhì)瘤中的研究結(jié)果，β-TrCP1 的表達(dá)具有組織異質(zhì)性，不同組織中的表達(dá)及作用需具體分析。

本研究發(fā)現(xiàn)HAUSP 蛋白陽(yáng)性率隨著膠質(zhì)瘤WHO 級(jí)別增高而增高。相關(guān)研究報(bào)道，HAUSP 在正常腦組織中呈低表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度升高HAUSP 的表達(dá)增加，這與本研究結(jié)果一致，表明HAUSP 可能是促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的重要因素[13]。此外，本研究證實(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HAUSP 與UHRF1呈正相關(guān)。由此推測(cè)惡性度較高的膠質(zhì)瘤中高表達(dá)的HAUSP 可能通過(guò)使UHRF1 蛋白去泛素化增強(qiáng)其穩(wěn)定性，繼而導(dǎo)致基因組因低甲基化而不穩(wěn)定，是促進(jìn)細(xì)胞惡性進(jìn)展的因素之一[9]。在肝癌、前列腺癌及乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)HAUSP 在癌組織中呈高表達(dá)，且與惡性進(jìn)展呈正相關(guān)[14-16]。此外，HAUSP 的表達(dá)與肺癌的病理分型有關(guān)，其在肺腺癌中的表達(dá)顯著低于在鱗狀細(xì)胞肺癌的表達(dá)[17]。由此提示，HAUSP的表達(dá)水平與多種腫瘤組織的分級(jí)和分型有關(guān)。

綜上所述，泛素化酶β-TrCP1 在膠質(zhì)瘤中可能起抑癌作用，去泛素化酶HAUSP 可能起促癌作用。惡性度高的膠質(zhì)瘤中，β-TrCP1 呈低表達(dá)，促使UHRF1 泛素化減少；而HAUSP 呈高表達(dá)，導(dǎo)致UHRF1 去泛素化，低泛素化水平使得UHRF1 降解減少，UHRF1 蛋白異常高表達(dá)，這可能是導(dǎo)致Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞高度惡性的重要因素之一。本研究為闡明膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的表觀遺傳分子機(jī)制和膠質(zhì)瘤的臨床診療提供理論依據(jù)。