劉淑娟 楊愛紅 周華 劉騰云 李彥強 鐘永達 余發(fā)新

摘要[目的]研究樟樹的開花及傳粉生物學特性。[方法]測量花部綜合特征，MTT法測花粉活性，聯(lián)苯胺-過氧化氫法測柱頭的可授性，通過異交指數(shù)、花粉胚珠比和人工授粉試驗測定樟樹的繁育系統(tǒng)類型，通過訪花觀察確定樟樹的主要傳粉者類型。[結果]樟樹的花較小，柱頭-花藥間存在一定的空間分離;樟樹的單花期3～4d，花粉的高活性可以持續(xù)到花開后的第3天，而柱頭具有較高的可授性是在花開的前2d;樟樹的繁育系統(tǒng)為兼性異交，自交親和，需要傳粉者，且樟樹的結實率受到傳粉者不足的限制，導致其自然結實率偏低，只有36.7%。[結論]該研究可為深入開展樟樹的種質資源保存、雜交育種以及良種選育等工作奠定基礎。

關鍵詞樟樹;傳粉生物學;繁育系統(tǒng);結實率;花粉活性;柱頭可授性

中圖分類號S718.4文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0111-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.034

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

樟樹（Cinnamomumcamphora）又名樟木、芳樟、小葉樟、烏樟等，是生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)的優(yōu)勢多用途樹種，與楠、梓、桐合稱為“江南四大名木”，為國家二級重點保護野生植物[1]。樟樹在我國既是珍貴的盛產芳香油類的經濟林樹種，又是水源涵養(yǎng)、河堤防護的重要防護林樹種，還是優(yōu)質的園林綠化樹種，具有重要的經濟和園藝價值，廣泛分布于北亞熱帶以南地區(qū)。野生樟樹主要分布于秦嶺、長江流域以南各省區(qū)，多分布于海拔300～1000m的低山丘陵地區(qū);人工培育的樟樹林分布更為廣泛，多栽培在海拔200m以下的丘陵、山地與平原等地區(qū)。樟樹性喜溫暖濕潤的氣候，耐濕熱、抗高溫，能夠適應40℃的高溫氣候;但不耐寒，因此一般適合種植在年平均氣溫16℃以上的亞熱帶以南地區(qū)[2-3]。樟樹的典型特征為樹形高大美觀（可達30～40m）、冠幅大、壽命長（成為古樹，壽命長達1000年以上）。樟樹木材致密美觀且切面光滑，自有一股獨特的芳香味，還可以防腐防蛀，因而被稱為“香樟”，廣泛用于制作家具、手工藝品以及供建筑、造船之用[4-5];樟樹是重要的行道樹和園林綠化樹種，病蟲害少，適宜栽種，在我國長江流域及以南地區(qū)被廣泛種植在居民小區(qū)、公園、道路兩側等。然而其結籽量大，落籽持續(xù)時間長，影響了地面的整潔與美觀，給環(huán)衛(wèi)工作者帶來了不小的工作，若能通過雜交育種選育出不結籽或結籽量小的樟樹新品種，將會大大提高樟樹的景觀利用價值。

此外，隨著天然林禁伐政策的實施，我國優(yōu)質用材樹種供求矛盾日益突出，尤其是珍貴闊葉材，其來源幾近枯竭。樟樹是熱帶亞熱帶常綠闊葉林的重要組成樹種之一，其高質量人工林的培育和開發(fā)利用對于緩解用材需求、滿足人們用材需求、保護環(huán)境等具有重要的作用。然而，當前樟樹的良種化水平低，尤其是材用樟樹的遺傳改良還沒有真正起步，現(xiàn)有樟樹通常存在生長速度慢、干形差、出材率低等問題，嚴重影響了其利用價值[6]，如果能夠通過雜交育種等措施選育出生長快、干形直、材質好的優(yōu)良品種，將會極大地促進工業(yè)原料林的發(fā)展以及樹種、林種結構的調整，提高森林質量。種種需求表明，開展樟樹雜交育種工作是樟樹優(yōu)良品種選育的重要途徑。現(xiàn)有對樟屬植物的研究還主要集中在生物學特性[7]、栽培和移植技術[8-9]、苗期的遺傳變異[10-11]、精油成分[12-13]、精油提取方法[13-15]、抗干旱及低溫脅迫[16-18]等方面，其雜交育種工作尚未起步。了解植物的繁育機理和交配系統(tǒng)類型是進行雜交育種和良種選育工作的前提，目前樟樹在這方面的研究還少之又少，這將嚴重阻礙其雜交育種及良種選育工作的開展，因此，對樟樹的繁育系統(tǒng)、交配模式及傳粉過程等進行系統(tǒng)性的基礎性研究勢在必行。筆者通過對樟樹花粉及柱頭活性、繁育系統(tǒng)、交配模式、傳粉過程等進行研究，揭示樟樹的繁育系統(tǒng)特性，旨在為今后深入開展樟樹的種質資源保存、雜交育種以及良種選育等工作奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

以分布于江西省科學院院內、南昌大學校內以及艾溪湖濕地公園等試驗點的樟樹為材料，試驗開展時間為2017、2018年的4—5月。樟樹的開花期為每年的4—5月，持續(xù)約30d，花小而多（圖1A），花藥2輪，內輪3個為敗育雄蕊，外輪6個花藥為可育雄蕊，柱頭1個，位于2輪雄蕊的中間（圖1B），單花花期3～4d（圖1C）。果實球形，成熟后為黑紫色，直徑約0.5cm，果實成熟期在10—11月。

1.2方法

1.2.1繁育系統(tǒng)。

1.2.1.1異交指數(shù)（outcrossingindex，OCI）的估算。測量花部綜合特征，包括花朵直徑、花藥開裂時間與柱頭可授期的時間間隔、柱頭與花藥的空間位置，按照Dafni[19]的標準對其進行繁育系統(tǒng)的描述。

1.2.1.2花粉胚珠比（pollenovuleratio，P/O）的估算。隨機采摘即將散粉的花蕾狀態(tài)的花15朵，用70%乙醇固定于離心管中并帶回實驗室。在實驗室，將整朵花放在小研缽中充分研碎，在5mL容量瓶中稀釋定容，充分振蕩搖勻，用移液槍隨機吸取5滴（每滴50μL）滴于載玻片上，在NikonE100顯微鏡100×倍數(shù)下數(shù)花粉的數(shù)量，取5滴的平均值乘以稀釋倍數(shù)100，即為該花的花粉產量[19-20]。將子房放在體視顯微鏡下解剖，并將胚珠均勻散開，統(tǒng)計胚珠數(shù)量。

47卷1期劉淑娟等樟樹的開花特性及傳粉生物學研究

1.2.1.3花粉活力與柱頭可授性。花粉活力測定采用MTT染色法[21-23]，事先將樟樹花苞套袋，花開一小口（針孔大?。┘撮_始散粉，將此狀態(tài)視為開花第1天，分別選取開花第1、2、3、4天的花各10朵，帶回實驗室測花粉活性。首先滴1～2滴MTT溶液在載玻片上，然后剝掉花瓣，手持花梗將花藥部分在MTT滴液里來回蹭幾次，蓋上蓋玻片。10min后在低倍鏡下觀察，選取5個視野，每個視野花粉數(shù)在30粒以上，取其平均值作為花粉活力指標。凡是染成深紅色甚至紫黑色的花粉，其生活力為強（圖1D），紅色的次之，無色的為不具活力的花粉或不育花粉?；ǚ刍盍?某視野變色的花粉粒數(shù)目/該視野花粉?？倲?shù)×100%。

柱頭可授性測定采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法[23]：隨機選擇處于開花前1d、開花第1天，第1、2、3、4天的花各10朵，將柱頭取下浸入凹面載玻片含有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應液（1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22，體積比）的凹陷處。若柱頭具可授性，則柱頭周圍呈現(xiàn)藍色并有大量氣泡出現(xiàn)。根據(jù)藍色深淺和氣泡多少表示可授性強弱。

1.2.1.4套袋及人工授粉試驗。在盛花期分別選取花苞狀態(tài)的花進行套袋處理，待袋內的花苞開放后再進行人工授粉處理：①套袋人工輔助自花，取自花或同株異花的花粉作為花粉供體，授在柱頭上，然后套袋直至花凋謝;②套袋人工輔助異花，將花苞狀態(tài)的花套袋，待花開放后，選擇另一試驗點的植株作為花粉源將花粉授到柱頭上，套袋直至花凋謝;③套袋自動自花處理，一直套袋直至花凋謝;④對照處理，自然狀態(tài)，不去雄，不套袋，使其自然授粉。一個植株內不同處理用不同顏色的尼龍線標記。整個授粉處理植株內，同一種處理用同一種顏色的尼龍線標記。

1.2.2

訪花昆蟲的觀察。盛花期分別在3個試驗點隨機選取樟樹1枝，統(tǒng)計正在開放的花數(shù)，以30min為一個時間段，從9：00—17：00記錄來訪昆蟲的種類、訪花數(shù)量、訪花行為及訪問單花的時間，總觀察時間大于30h。

1.2.3數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、做圖均采用SPSS19.0軟件，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，N代表樣本量。

2結果與分析

2.1繁育系統(tǒng)

2.1.1異交指數(shù)（OCI）。按照Dafni[19]的標準進行花序直徑、花朵大小和開花行為的測量及繁育系統(tǒng)的評判，具體方法：①花朵或花序直徑<1mm記為0，1～2mm記為1，2～6mm記為2，>6mm記為3;②花藥開裂時間與柱頭可授期的時間間隔，同時或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1;③柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0，空間分離記為1，三者之和為OCI值。

評判標準：OCI為0時，繁育系統(tǒng)為閉花受精;OCI=1時，繁育系統(tǒng)為專性自交;OCI為2時，繁育系統(tǒng)為兼性自交;OCI為3時，繁育系統(tǒng)為自交親和，有時需要傳粉者;OCI為4時，繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交，需要傳粉者。據(jù)此標準，樟樹的開花直徑為（4.98±0.51）mm，記為2;柱頭和花藥幾乎同時成熟或雌蕊先熟，記為0;柱頭和花藥間有分離，記為1。樟樹的OCI得分為3，其繁育系統(tǒng)為自交親和，需要傳粉者。

2.1.2花粉胚珠比（P/O）。樟樹的平均花粉產量是2047，而胚珠數(shù)為1，因此其花粉胚珠比為2047，根據(jù)Cruden[24]的標準：P/O為2.7～5.4時，其繁育系統(tǒng)為閉花受精;P/O為18.1～39.0時，繁育系統(tǒng)為專性自交;P/O為31.9～396.0時，繁育系統(tǒng)為兼性自交;P/O為244.7～2588.0時，繁育系統(tǒng)為兼性異交;P/O為2108.0～195525.0時，繁育系統(tǒng)為專性異交。樟樹的P/O為2047，據(jù)此標準可判斷其繁育系統(tǒng)為兼性異交。

2.1.3花粉活力與柱頭可授性。樟樹花在剛開一小孔時花藥已散粉，且花粉具有較高活性，花粉高活性一直持續(xù)到花開第3天，第4天開始，花開始萎蔫，花藥和柱頭均開始變黑，花粉活力明顯降低（圖2）。柱頭在開花第1天，即花剛開一小孔時，具有較強的可授性（++），之后的第2（+）、3（+/-）天，柱頭的可授性逐漸減弱，到第4天完全失活，柱頭沒有可授性（-）。

2.1.4套袋及人工授粉試驗。套袋試驗結果發(fā)現(xiàn)，4種處理下的樟樹均能結實。其中，經人工異交授粉處理的結實率與結籽率均顯著高于其他處理（表1）。無論是套袋自動自花授粉還是人工輔助自花授粉，樟樹都可以結實，說明樟樹具有一定的自交親和性;而套袋后人工輔助異花授粉可以明顯提高樟樹的結實率，說明自然條件下，樟樹存在異源花粉限制。綜上所述，樟樹的繁育系統(tǒng)為兼性異交，自交親和。

2.2訪花昆蟲的觀察

訪花觀察發(fā)現(xiàn)，樟樹的主要傳粉昆蟲是食蚜蠅（Syrphidae，圖1E），其次是蜜蜂（Apismellifera，圖1F），偶爾見到蠅類訪問。食蚜蠅的訪花時間從09：00開始，隨著溫度升高，活動量也逐漸加大，至15：00—16：00，訪花的食蚜蠅最多，活動量也達到最大。食蚜蠅在訪問樟樹時，會在同一株上連續(xù)訪問十幾至二十朵花，平均每小時每花的被訪問次數(shù)為0.016次，每朵花的平均停留時間為2～3s。蜜蜂的訪花高峰期在10：00—12：00，下午相對較少，總體訪花頻率也較低，平均每小時訪花數(shù)為0.012，每朵花的停留時間為1～2s。蠅類的訪花頻率最低，偶爾可見1只，一次訪問1～2朵花。

3結論與討論

3.1樟樹的開花特性與傳粉適應樟樹的花在開放第1天，即剛剛裂開一小孔時，花藥即開始散粉且花粉具有較高的活性（大于97%），此時的柱頭同樣具有較強的可授性，但由于這個時候柱頭花藥間存在一定距離，柱頭位于花藥的下方，即柱頭花藥間在空間上有一定隔離，這大大降低了自動自花授粉的可能性[25]。隨著開花天數(shù)的推移，花粉持續(xù)保持較高活性（90%以上），但柱頭具有較強可授性僅持續(xù)2d，到了第3天，柱頭活性減弱，柱頭-花藥間的空間分離也逐漸縮小?？梢姡_花前期柱頭花藥空間結構上的分離是一種避免自花授粉的機制[26]。

然而，樟樹輔助自花授粉的結實率跟自然授粉的結果相似，推測自然狀態(tài)下樟樹的座果在很大程度上來自同株異化授粉，這主要依據(jù)野外訪花觀察結果。樟樹單株的開花量巨大，其主要訪花者食蚜蠅或蜜蜂會在同一棵樟樹上連續(xù)訪花10朵以上，這樣就會限制花粉的來源，造成同株異花授粉。此外，樟樹的開花期恰值陰雨季節(jié)，溫度較低，陰、雨等惡劣天氣不僅影響昆蟲訪花頻率，也影響花粉及柱頭的生活力[27]。氣象因素還影響生境內的昆蟲區(qū)系，進而影響樟樹訪花者的種類和數(shù)量[28]。樟樹的傳粉昆蟲種類單一，主要是食蚜蠅或蜜蜂，訪問頻率均較低，且食蚜蠅傳粉效率低，而樟樹的柱頭可授期短（2d），因此受天氣的影響嚴重，最終影響到樟樹的結實率，導致跟其開花量相比，樟樹的自然結實率較低，為36.7%。

3.2樟樹繁育系統(tǒng)類型的判定

根據(jù)Dafni[19]的標準和Gruden[24]的標準可知，兩指標的結果基本一致，樟樹的繁育系統(tǒng)是兼性異交，自交親和，這和人工授粉及訪花觀察的結果也是一致的。OCI檢測是從植物形態(tài)適應蟲媒傳粉出發(fā)，相對于P/O準確性更高[29]。而人工控制授粉試驗則排除了環(huán)境因素和授粉過程的差異，直接關注柱頭和花粉識別對結實率的影響，為3種方法中最為有效的檢測方式[30]。從不同來源花粉授粉的結果看，輔助自花授粉處理的結實率明顯低于輔助異株異花授粉處理，可見樟樹存在一定的近交衰退，而自然授粉的平均結實率與異株異花授粉處理之間的統(tǒng)計分析結果差異顯著，說明樟樹自然條件下的有性繁殖系統(tǒng)受到花粉限制和缺少傳粉昆蟲的影響[31-32]。該研究綜合3種測定方法的結果，判定樟樹為兼性異交，自交親和，需要傳粉者（該結果和Shivaprasad等[33]對樟屬C.sulphuratum的研究結果一致），且結實率受到傳粉者不足的限制。后續(xù)試驗將會對樟樹不同授粉處理的種子萌發(fā)情況及萌發(fā)規(guī)律做進一步研究，從種子萌發(fā)層面判定樟樹的近交衰退水平及繁育系統(tǒng)類型。

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