由希華，徐 標(biāo)，李恒慶，宗雪梅

山東省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，山東 濟(jì)南 250101

糞大腸菌群，是指一群能在(44.5±0.5)℃ 溫度下生長(zhǎng)，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，國(guó)外又稱耐熱大腸菌群。主要來源于人畜糞便，可導(dǎo)致腸道傳染病傳播[1]。水源水一旦被糞便污染，就存在腸道病原菌污染引起腸道傳染病甚至流行病的可能。因此，糞大腸菌群的檢測(cè)可準(zhǔn)確及時(shí)地監(jiān)控水源水受糞便污染的狀況，為相關(guān)部門有效預(yù)報(bào)和控制流行疾病的發(fā)生與傳播提供重要依據(jù)。

目前，國(guó)內(nèi)外糞大腸菌群的檢測(cè)方法可分為多管發(fā)酵法、快速紙片法、濾膜法、酶底物法、熒光原位雜交(FISH) 技術(shù)、PCR 技術(shù)等[1-3]。國(guó)內(nèi)糞大腸菌群監(jiān)測(cè)方法主要有濾膜法、多管發(fā)酵法，并且這2種方法均屬于國(guó)標(biāo)方法[4]，被國(guó)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測(cè)部門廣泛采用。這2種方法分析成本低，結(jié)果較準(zhǔn)確，但是操作繁瑣，需專業(yè)人員嚴(yán)格控制無菌條件，操作時(shí)間長(zhǎng)(至少需要48 h)，并需要驗(yàn)證試驗(yàn)，不能快速對(duì)水的衛(wèi)生狀況作出評(píng)價(jià)[3]，不適合應(yīng)急現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。因此，采用更為快速、簡(jiǎn)便、精確的監(jiān)測(cè)方法顯得尤為重要。熒光法可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足，無需專業(yè)技術(shù)人員和嚴(yán)格無菌條件，無需驗(yàn)證試驗(yàn)。熒光法操作簡(jiǎn)單，一般人員經(jīng)過簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可在現(xiàn)場(chǎng)完成操作，并且測(cè)定范圍廣，無需稀釋，測(cè)定范圍可達(dá)108MPN/100 mL，消除了人為帶入的誤差。全自動(dòng)微生物監(jiān)測(cè)儀可獨(dú)立自動(dòng)完成培養(yǎng)、測(cè)試、結(jié)果判讀、發(fā)送報(bào)告等工作，故不受場(chǎng)地限制，可直接應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)時(shí)間為動(dòng)態(tài)時(shí)間，與待測(cè)樣本中目標(biāo)細(xì)菌的濃度有關(guān)，濃度越高，檢測(cè)時(shí)間越短，最快可2 h內(nèi)給出陽性測(cè)試報(bào)告，最長(zhǎng)需要18 h。并可在第一時(shí)間將測(cè)試報(bào)告發(fā)送到指定郵箱，更適合應(yīng)用于應(yīng)急現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，做到早期預(yù)警，防止進(jìn)一步危害的發(fā)生。

2010年，加拿大皇后大學(xué)研究人員和加拿大水質(zhì)專家組成科研團(tuán)隊(duì)，提出使用聚合物光學(xué)傳感器檢測(cè)同類型微生物熒光指標(biāo)的方法。該方法目前已經(jīng)在全球十余個(gè)國(guó)家和地區(qū)得到廣泛應(yīng)用，并獲得多個(gè)權(quán)威部門的認(rèn)證，這些部門包括中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、美國(guó)環(huán)保署、AOAC協(xié)會(huì)、新西蘭衛(wèi)生部、菲律賓衛(wèi)生部等。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備及試劑

實(shí)驗(yàn)所用儀器和設(shè)備主要有微生物快速測(cè)定儀、培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、天平、采樣瓶等。

實(shí)驗(yàn)試劑包括：糞大腸檢測(cè)試劑套筒(以下簡(jiǎn)稱FCA套筒)、乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、硫代硫酸鈉溶液、無菌水等。

1.2 反應(yīng)原理

將一定量的水樣與培養(yǎng)基混合均勻放置于44.5 ℃溫度下培養(yǎng)，糞大腸菌群在選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，并分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物(疏水)。熒光產(chǎn)物逃離水樣聚合至光學(xué)檢測(cè)區(qū)，通過光度計(jì)測(cè)定，依據(jù)熒光強(qiáng)度與水中糞大腸菌群數(shù)成一定關(guān)系的原理，建立數(shù)學(xué)模型，從而得出糞大腸菌群的濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

打開電源開關(guān)，設(shè)置添加樣品，錄入樣品編號(hào)，選擇TECTA-FCA-FC選項(xiàng)，點(diǎn)擊“ADD”，設(shè)置完成。將注入100 mL水樣的FCA套筒放入指定檢測(cè)池。關(guān)閉上蓋，儀器開始自動(dòng)檢測(cè)。當(dāng)儀器檢測(cè)到糞大腸菌群，自動(dòng)檢測(cè)停止，并報(bào)告檢測(cè)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 準(zhǔn)確度的測(cè)定

微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，按其統(tǒng)計(jì)分析要求，檢測(cè)所得結(jié)果全部經(jīng)對(duì)數(shù)(以10為底)轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度的統(tǒng)計(jì)分析。

采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)美國(guó)IDEXX糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株(NCTC 9001)驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性，標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度為653MPN/100 mL(65～1 350MPN/100 mL)。

將無菌水加入FCA套筒中，并定容至100 mL。將標(biāo)準(zhǔn)菌株加入套筒中，蓋緊上蓋，搖勻。放入微生物檢測(cè)儀中檢測(cè)。

在6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行測(cè)定，每家實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定6次，測(cè)試結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)菌株測(cè)試結(jié)果Table 1 Standard strain testing results MPN/L

對(duì)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)誤差，以計(jì)算熒光法的準(zhǔn)確度。結(jié)果表明：6家實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度(65～1 350MPN/100 mL)誤差范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)誤差為-2.75%～1.71%，準(zhǔn)確度較高。

2.2 精密度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)室精密度的研究需要采集高(4.6×107MPN/L)、中(4.6×105MPN/L)、低(4.6×103MPN/L)3個(gè)不同濃度水平實(shí)際水樣進(jìn)行測(cè)試，在6家實(shí)驗(yàn)室中每家實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定6次。

將待測(cè)水樣加入FCA套筒中，并定容至100 mL。蓋緊上蓋，搖勻，放入微生物檢測(cè)儀中檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果見表2～表7。

表2 1號(hào)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際水樣精密度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 2 No.1 laboratory regular water sample precision test data

注：i為實(shí)驗(yàn)次數(shù)，S和RSD為原始數(shù)據(jù)以10為底，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后計(jì)算所得，下同。

表3 2號(hào)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際水樣精密度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 3 No.2 laboratory regular water sample precision test data

表4 3號(hào)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際水樣精密度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 4 No.3 laboratory regular water sample precision test data

表5 4號(hào)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際水樣精密度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 5 No.4 laboratory regular water sample precision test data

表6 5號(hào)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際水樣精密度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 6 No.5 laboratory regular water sample precision test data

表7 6號(hào)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際水樣精密度測(cè)試數(shù)據(jù)Table 7 No.6 laboratory regular water sample precision test data

對(duì)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度，以實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)偏差表示[5]。監(jiān)測(cè)結(jié)果表明：6家實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為1.30%～3.93%、1.94%～4.72%、1.88%～4.54%，實(shí)驗(yàn)室間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.14%、1.59%、1.72%，精密度較高。

2.3 熒光法與多管發(fā)酵法相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

選擇不同的地表水、廢水樣品進(jìn)行熒光法與多管發(fā)酵法比對(duì)測(cè)試[6-9]，討論方法適用性。實(shí)驗(yàn)中采用38份地表水及污水水樣進(jìn)行糞大腸菌群的監(jiān)測(cè)，多管發(fā)酵法所用培養(yǎng)基、試劑和測(cè)定方法參照《水質(zhì) 糞大腸菌群的測(cè)定 多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》[4]的相關(guān)要求，熒光法操作步驟同上，熒光法和多管發(fā)酵法測(cè)糞大腸菌群的線性回歸分析見圖1。相關(guān)系數(shù)(r)為0.984 4，標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)為0.984，回歸系數(shù)(B)為1.077，表明熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相關(guān)關(guān)系。

圖1 2種方法測(cè)定結(jié)果變化趨勢(shì)Fig.1 The tendency chart of the ammonium determined by the methods

對(duì)2種方法檢測(cè)的糞大腸菌群結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)[10-11]，用來檢驗(yàn)2種方法測(cè)定結(jié)果的差異性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，2種方法無顯著差異。結(jié)果見表8。

表8 熒光法和多管發(fā)酵法t檢驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of t test by fluorescence and multi-tube method

3 結(jié)論

精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)表明，熒光法測(cè)定糞大腸菌群具有較高精密度和準(zhǔn)確度；熒光法和多管發(fā)酵法相關(guān)性實(shí)驗(yàn)表明，2種方法在測(cè)定結(jié)果一致性、相關(guān)性等方面沒有顯著差異，初步認(rèn)為熒光法可應(yīng)用于地表水和廢水中糞大腸菌群的檢測(cè)。

熒光法相比于傳統(tǒng)多管發(fā)酵法具有明顯優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，監(jiān)測(cè)時(shí)間短，可在現(xiàn)場(chǎng)直接監(jiān)測(cè)，測(cè)定范圍廣，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，能快速判斷水樣的微生物污染狀況，尤其適用于應(yīng)急現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，可應(yīng)用于地表水、廢水中的糞大腸菌群檢測(cè)。