吳賢生 黃甘泉 楊嘉俊 王鳳姬 嚴(yán)家榮 鐘志勇 鄺少松

(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心 佛山 528248)

促肝細(xì)胞生長素(hepatocyte growth-promoting factors, HGPF)是從新鮮乳豬健康肝臟中提取的多肽和核苷酸制品，具有促進肝臟細(xì)胞分裂生長，加速損傷肝臟的修復(fù)的作用[1-2]。HPGF在臨床上廣泛用于治療肝炎、肺纖維化和心、腎血管疾病[3]，同時相關(guān)不良反應(yīng)報道也日益增多[4-5]。低血糖是促肝細(xì)胞生長素的常見臨床不良反應(yīng)，并常伴隨血壓下降、出冷汗、惡心嘔吐、心慌、意識改變、四肢冰冷和煩躁等癥狀[5]。

組胺、緩激肽一類的物質(zhì)因具有血管擴張作用，在注入機體后易引起血壓快速下降。來自動、植物、微生物發(fā)酵提取物及生產(chǎn)過程中有可能混入組胺類或類組胺類物質(zhì)的原料和注射劑(靜脈)應(yīng)建立降壓物質(zhì)檢查項，如抗生素、中藥注射劑、氨基酸和多肽類[6]。近3版《中國藥典》(2005年版、2010年版和2015年版)中降壓物質(zhì)檢查方法均是通過比較藥物和標(biāo)準(zhǔn)品引起動物血壓變化的大小進行判定降壓物質(zhì)是否合格，所選用實驗對象為貓。然而當(dāng)前我國未建立實驗貓的繁殖、培育和檢驗相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，用于降壓物質(zhì)檢查的家貓均為非標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物，其個體差異不可控制，健康狀況無法保證，同時因這些家貓常常攜帶寄生蟲和微生物，對實驗結(jié)果以及實驗人員的安全均產(chǎn)生威脅和影響[7-9]?！吨袊幍洹?015年版正式將組胺類物質(zhì)檢查法(豚鼠離體回腸法)收錄為通則之一，作為降壓物質(zhì)檢查法的補充和替代方法[10]。推廣組胺類物質(zhì)檢查法替代現(xiàn)有的降壓物質(zhì)檢查法，必將大量減少貓在降壓物質(zhì)檢查中的應(yīng)用。

現(xiàn)代藥物生產(chǎn)工藝的改進以及對相關(guān)物質(zhì)的控制，使得我們難以獲得明顯引起機體血壓下降的藥品，以陰性樣品進行探討檢查方法，會增大假陽性的可能；采用加標(biāo)方法進行研究和檢查，會增大假陰性的可能。我中心在進行藥物安全性檢查時，偶然發(fā)現(xiàn)3個批次引起動物血壓明顯下降但仍滿足《中國藥典》中關(guān)于降壓物質(zhì)檢查要求的注射用促肝細(xì)胞生長素。注射用促肝細(xì)胞生長素的降壓物質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)制定，而組胺類物質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)未見報道。本實驗旨在通過比較這些批次的注射用促肝細(xì)胞生長素組胺類物質(zhì)檢查法和降壓物質(zhì)檢查法結(jié)果的異同，探討在注射用促肝細(xì)胞生長素安全性檢查中，以組胺類物質(zhì)檢查法替代降壓物質(zhì)檢查法的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級豚鼠，體質(zhì)量250～350 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)：2013-0002。家貓，購買于廣東省佛山市南海區(qū)黃岐周邊農(nóng)村。

1.2 藥品與試劑

注射用促肝細(xì)胞生長素，批號：16010101、16010301、16010501；磷酸組織胺，中國藥品生物制品檢定所；戊巴比妥鈉，德國默克公司；肝素鈉，廣東晶欣生物科技有限公司；鹽酸賽拉嗪注射液，吉林省方正動物藥業(yè)科技有限責(zé)任公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉，廣州市中南化學(xué)試劑有限公司；碳酸氫鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈣，廣州化學(xué)試劑二廠；氯化鎂(含6個結(jié)晶水)、葡萄糖(含1個結(jié)晶水)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；硫酸阿托品注射液，吉林省華牧動物保健有限公司；滅菌注射用水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司；0.9%氯化鈉注射液，貴州天地藥業(yè)有限公司；去離子水，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心生產(chǎn)；氧氣和二氧化碳混合氣體(O2∶CO2=95∶5)，廣州珠江氣體有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

BL-420F/S生理機能儀，成都泰盟科技有限公司；恒溫HW-400E恒溫平滑肌槽，成都泰盟科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1降壓物質(zhì)檢查法：參照《中國藥典》2015年版. 四部. 通則1145 降壓物質(zhì)檢查法進行。動物對降壓物質(zhì)靈敏度檢查符合要求后，取對照品溶液(dS)按0.10μg/kg體質(zhì)量劑量，供試品溶液(dT)按2 mg/kg體質(zhì)量劑量注射，照下列次序注射一組4個劑量：dS1、dT1、dT2、dS2，然后以dS1與dT2、dT1與dS2劑量所致的反應(yīng)分別比較，依照《中國藥典》2015年版中判定標(biāo)準(zhǔn)對受試樣品降壓物質(zhì)檢查結(jié)果進行判定。

1.4.2組胺類物質(zhì)檢查：參照《中國藥典》2015年版. 四部. 通則1 146組胺類物質(zhì)檢查法進行。

(1)組胺類物質(zhì)檢查中對照品高低濃度確定：按照對照品浴槽終濃度從小到大的次序，將對照品依次加入浴槽(浴槽體積為20 mL)，注射量均為0.2 mL。根據(jù)豚鼠離體回腸的收縮反應(yīng)，選擇其中能引起豚鼠離體回腸收縮的2個劑量設(shè)定為高、低劑量，低劑量能引起豚鼠離體回腸明顯收縮，高劑量不致使回腸收縮達到極限，且高低劑量所致回腸的收縮有明顯差別，高低劑量比為1∶0.5左右，高、低劑量分別標(biāo)示為dS2和dS1。

(2)組胺類物質(zhì)檢查理論限值確定：根據(jù)中國藥典委員會發(fā)布《注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》，組胺類物質(zhì)檢查原則上與降壓物質(zhì)檢查限值一致。根據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-10001-(HD-0828)-2002規(guī)定[11]，注射用促肝細(xì)胞生長素降壓物質(zhì)檢查注射劑量為2 mg/kg，對應(yīng)組胺標(biāo)準(zhǔn)品劑量為0.10 μg/kg，則dT=20 000 dS。

(3)組胺類物質(zhì)檢查和判定：照下列次序準(zhǔn)確注入浴槽6個劑量：dS2、dS1、dT、dT、dS1、dS2，如dS2所致的反應(yīng)值大于dS1所致的反應(yīng)值并且可重復(fù)時判定試驗有效。

(4)干擾實驗：按照限值劑量在注射用促肝細(xì)胞生長素溶液中加入組胺對照品高、低劑量，并按下列次序準(zhǔn)確注入dS2、dS1+T、dS2+T、dS1，重復(fù)一次，研究注射用促肝細(xì)胞生長素對回腸收縮的干擾。

(5)注射用促肝細(xì)胞生長素組胺類物質(zhì)檢查靈敏度實驗：分別將0.2、0.5、1、2、5、10 mg/mL的注射用促肝細(xì)胞生長素溶液注入浴槽，注射體積均為0.2 mL，研究不同濃度劑量下豚鼠離體回腸的收縮情況。

2 結(jié)果

2.1 降壓物質(zhì)檢查結(jié)果

以2 mg/kg的注射劑量將促肝細(xì)胞生長素注入貓體內(nèi)后，均引起了貓血壓的下降，下降幅度約為對照品的50%。3個批次藥品的降壓物質(zhì)檢查結(jié)果如表1所列，并選擇其中1個批次藥品降壓物質(zhì)檢查過程中貓血壓的變化情況進行繪圖，見圖1。3批注射用促肝細(xì)胞生長素在降壓物質(zhì)檢查中，藥品引起的貓血壓下降值均小于相應(yīng)對照品引起的血壓下降值，根據(jù)《中國藥典》2015年版相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，可判定3批注射用促肝細(xì)胞生長素降壓物質(zhì)檢查均合格。

圖1 注射用促肝細(xì)胞生長素(批號：16010101)組胺類物質(zhì)檢查試驗結(jié)果Fig.1 Result of depressor substance test of hepatocyte growth-promoting factors for injection (Lot No. 16010101)

藥品批號輪次組胺注射用促肝細(xì)胞生長素劑量/(μg/kg)dS1/kPadS2/kPa劑量/(mg/kg)dT1/kPadT2/kPa16010101第1輪0.13.263.0721.531.72第2輪0.13.182.9021.601.9516010301第1輪0.14.415.0822.002.84第2輪0.15.314.2422.341.6816010501第1輪0.13.604.6322.483.10第2輪0.14.435.7022.683.26

2.2 組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果

(1)不同濃度組胺對回腸收縮的影響：往離體浴槽中分別依次加入不同劑量的組胺溶液，觀察并記錄豚鼠離體回腸收縮情況。不同劑量組胺引起豚鼠回腸張力變化結(jié)果如表2，并將這一過程豚鼠離體回腸張力變化情況進行繪圖見圖2。隨后選擇浴槽組胺終濃度0.1 μg/mL為低劑量對照(dS1)，0.2 μg/mL為高劑量對照(dS2)，進行2輪注射驗證，高低劑量差別明顯且重復(fù)性好(表2、圖2)，故在后期組胺類物質(zhì)檢查中選擇這兩個劑量作為高、低劑量。

表2 不同濃度組胺對豚鼠離體回腸收縮張力影響Table 2 Contractility of isolated ileum that caused byhistamine of different concentration

(2)注射用肝細(xì)胞生長素組胺類物質(zhì)檢查限值計算：降壓物質(zhì)檢查中，組胺對照品注射劑量為0.1 μg/kg，對應(yīng)促肝細(xì)胞生長素注射劑量為2 mg/kg。組胺類物質(zhì)檢查原則上與降壓物質(zhì)檢查限值一致，則組胺類物質(zhì)限值dT=20 000 dS，選定dS1浴槽終濃度為0.01 μg/mL，則dT=0.2 mg/mL，注射用肝細(xì)胞生長素溶液濃度為20 mg/mL。

(3)組胺類物質(zhì)檢查：組胺類物質(zhì)檢查中，dS2引起回腸收縮明顯大于dS1，且可重復(fù)，結(jié)果成立。3個批次藥品的組胺列物質(zhì)檢查結(jié)果如表3所列，選擇其中1個批次的檢查結(jié)果繪制豚鼠離體回腸張力變化圖，見圖3。注射注射用促肝細(xì)胞生長素溶液后，豚鼠回腸未見收縮，需按照限值劑量在供試品溶液中加入組胺對照品高、低劑量進行干擾實驗。

圖2 不同濃度的組胺對照品對豚鼠離體回腸收縮張力的影響Fig.2 Contractility of isolated ileum that caused by histamine of different concentration

藥品批號離體回腸收縮力/gdS2dS1dTdTdS1dS2160101013.872.45002.364.02160103014.122.65002.544.07160105014.202.41002.663.97

圖3 注射用促肝細(xì)胞生長素(批號：16030101)組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果Fig.3 Result of histamine-like substance test of hepatocyte growth-promoting factors for injection (Lot No. 16010101)

(4)干擾實驗結(jié)果：依次注入dS2、dS1+T、dS2+T、dS1，重復(fù)一次，各批次檢查結(jié)果如表4所列，選擇其中1個批次的檢查結(jié)果繪制豚鼠離體回腸張力變化圖，見圖4。注射用促肝細(xì)胞生長素-組胺溶液產(chǎn)生的收縮與對應(yīng)組胺對照品高、低劑量的收縮基本一致，可排除注射用促肝細(xì)胞生長素-組胺溶液對離體回腸的干擾。根據(jù)《中國藥典》2015年版相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)，可認(rèn)為注射用促肝細(xì)胞生長素組胺類物質(zhì)檢查合格。

表4 注射用促肝細(xì)胞生長素組胺類物質(zhì)檢查干擾實驗結(jié)果Table 4 Result of interference experiment for histamine-like substance test of hepatocyte growth-promoting factors for injection

2.3 注射用促肝細(xì)胞生長素降壓物質(zhì)檢查與組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果比較

依照《中國藥典》2015年版中的檢查方法和判定標(biāo)準(zhǔn)，3批注射用促肝細(xì)胞生長素降壓物質(zhì)檢查和組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果均為符合規(guī)定。但從實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，在降壓物質(zhì)檢查中供試品引起了貓血壓的明顯下降。以供試品引起貓血壓下降的均值/對照品引起貓血壓下降均值，計算二者引起貓血壓變化的比例，則3批供試品所致貓血壓下降分別是對照品的54.8%、46.5%和62.7%。而在組胺類物質(zhì)檢查過程中，供試品并未引起豚鼠離體回腸的收縮，也未對回腸對組胺的靈敏度產(chǎn)生干擾，根據(jù)檢查法中判定標(biāo)準(zhǔn)雖可判定組胺類物質(zhì)檢查合格，但與降壓物質(zhì)檢查結(jié)果相比較，組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果未能較好地反應(yīng)出供試品對動物血壓帶來的影響。

圖4 注射用促肝細(xì)胞生長素(批號：16010101)組胺類物質(zhì)檢查干擾實驗結(jié)果注：dS2濃度：0.02 μg/mL；dS1濃度：0.01 μg/mL；dT濃度：0.2 mg/mL(浴槽濃度)Fig.4 Result of interference experiment for histamine-like substance test of hepatocytegrowth-promoting factors for injection (Lot No. 16010101)Note： dS2: 0.02 μg/mL; dS1: 0.01μg/mL and dT: 0.2 mg/mL (final concentration)

3 討論

組胺類物質(zhì)檢查法作為降壓物質(zhì)檢查法的補充和替代，被《中國藥典》2015年版正式收錄。推廣組胺類物質(zhì)檢查法將有利于規(guī)范和減少非標(biāo)準(zhǔn)化貓的使用，符合動物倫理和3R原則，同時也可使實驗質(zhì)量得到保障。但目前已經(jīng)建立起組胺類物質(zhì)檢查方法的藥品品種甚少，組胺類物質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)的建立，尤其是限值劑量的設(shè)定仍需大量工作推進。

在本次實驗中，對降壓物質(zhì)檢查和組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果進行比較后我們發(fā)現(xiàn)在降壓物質(zhì)檢查中呈陽性結(jié)果(引起貓血壓明顯下降)的3批注射用促肝細(xì)胞生長素組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果均呈陰性。此結(jié)果提示3批供試品中所含組胺的量均低于限值，則在整體水平上的降壓物質(zhì)檢查過程中，是什么物質(zhì)導(dǎo)致了貓血壓的下降？同樣的情況在中藥注射劑檢查中也有出現(xiàn)[12]。我們推測可能是藥物注射入貓體內(nèi)后，引起了內(nèi)源性的組胺類物質(zhì)釋放，從而導(dǎo)致貓血壓下降。而內(nèi)源性組胺類物質(zhì)如何定位和檢測，仍需進一步研究。

本實驗中，降壓物質(zhì)檢查和組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果的差異提示組胺類物質(zhì)檢查合格時，仍可能會有降壓物質(zhì)檢查不滿足規(guī)定的情況出現(xiàn)，所以體外實驗的結(jié)果不能簡單地擴推到體內(nèi)實驗。同時反推回來，在組胺類物質(zhì)檢查方法學(xué)研究過程中，應(yīng)用降壓物質(zhì)檢查結(jié)果陰性的供試品進行組胺類物質(zhì)檢查的方法學(xué)研究，可能會增大假陽性結(jié)論的可能性。在未能充分驗證注射劑組胺類物質(zhì)檢查結(jié)果的有效性以及和降壓物質(zhì)檢查結(jié)果的一致性時，不能簡單地以組胺類物質(zhì)檢查來代表降壓物質(zhì)檢查結(jié)果。