馮書(shū)堂 牟玉蓮 王太平 莊愛(ài)萍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)(2.北京蓋蘭德生物科技有限公司， 北京 100007)

由于近交系動(dòng)物遺傳穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏、生物學(xué)特性一致性好，能提供精確、科學(xué)的檢測(cè)結(jié)果，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)眾多領(lǐng)域，如單克隆抗體制備等，并由此創(chuàng)建了多項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的理論學(xué)說(shuō)，帶來(lái)了年收益達(dá)上億元的生物醫(yī)藥價(jià)值[1]。哺乳動(dòng)物近交系動(dòng)物，已成為解決人類(lèi)疑難病癥和生命基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域研究中不可或缺的技術(shù)平臺(tái)之一。

自Clarence C. Little于1909年研究建立了第一個(gè)近交系鼠以來(lái)[2]，先后建立了同工酶蛋白質(zhì)鑒定研究、生化標(biāo)記鑒定研究、微衛(wèi)星變異和異體皮膚移植鑒定技術(shù)方法，如，相關(guān)生理生化標(biāo)記、DNA指紋圖、皮膚移植、DNA遺傳標(biāo)記、SNP分析等分子遺傳學(xué)的方法[3]。隨著哺乳動(dòng)物近交系小鼠遺傳鑒定的研究方法標(biāo)準(zhǔn)的建立，大大加快了哺乳動(dòng)物遺傳近交系培育與應(yīng)用研究的步伐，目前已培育出數(shù)百種近交系鼠類(lèi)等小型哺乳動(dòng)物。

由于大型哺乳動(dòng)物豬在生殖、生理、代謝等的諸多特異性，上世紀(jì)50年代雖大規(guī)模地開(kāi)展了近交系豬培育研究未獲得成功，所以其鑒定研究也未有建樹(shù)。隨著近50年來(lái)中國(guó)在大型哺乳動(dòng)物近交系豬資源創(chuàng)新研究中取得了突破性進(jìn)展，參照近交系鼠國(guó)際公認(rèn)的技術(shù)方法，先后開(kāi)展了同工酶蛋白質(zhì)、DNA遺傳標(biāo)記、特異等位基因、SNP分析和異體皮膚移植鑒定技術(shù)等方法[4-10]，使大型哺乳動(dòng)物近交系實(shí)驗(yàn)用小型豬鑒定研究取得了重大進(jìn)展。分述如下：

1 創(chuàng)建了豬近交系異體皮膚移植鑒定方法

皮膚移植是鑒定近交系鼠類(lèi)最經(jīng)典、有效的方法， 國(guó)內(nèi)外有關(guān)近交系鼠異體皮膚移植鑒定已有許多報(bào)道[10]。依據(jù)近交系鼠皮膚移植鑒定技術(shù)原理，結(jié)合實(shí)驗(yàn)用小型豬的生理種質(zhì)特性，中國(guó)的Mu等與解放軍304醫(yī)院合作研究[11]，以近交系F20為材料，率先開(kāi)展了五指山小型豬近交系異體皮膚移植鑒定方法研究，未發(fā)生免疫反應(yīng)，證明五指山小型豬近交系培育成功。創(chuàng)建了近交系豬的異體皮膚移植鑒定方法，其技術(shù)要點(diǎn)如下：(1)需對(duì)試驗(yàn)組(異體皮膚移植)和對(duì)照組(自體皮膚移植)公母豬合理安排；(2)測(cè)試用豬大小限制在3.5月齡以?xún)?nèi)；(3)皮瓣移植面積不小于4 cm×6 cm；(4)每周需對(duì)皮膚創(chuàng)面觀察一次，連續(xù)4周。早期7～14 d，主要觀察移植創(chuàng)面皮膚顏色、血運(yùn)建立及移植皮膚的存活率等；移植14 d以后，觀察移植創(chuàng)面無(wú)明顯紅腫、滲出、水泡、脫屑、脫落、潰瘍、壞死等排斥反應(yīng)現(xiàn)象；(5)觀察期同時(shí)對(duì)其進(jìn)行外周血與免疫相關(guān)細(xì)胞、生長(zhǎng)因子等測(cè)定，進(jìn)行移植皮膚和正常皮膚免疫組化H.E、Masson染色等超微結(jié)構(gòu)變化觀測(cè)。依據(jù)上述5種研究結(jié)果，實(shí)驗(yàn)豬與對(duì)照組兩組間是否反應(yīng)一致，最終可判斷為測(cè)試豬異體皮膚移植未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，即可判斷該測(cè)試近交系豬培育成功。這一鑒定方法，為大型哺乳動(dòng)物近交系的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。截至目前，國(guó)外雖有近交系豬異體皮膚移植研究論文[11-12]，但國(guó)內(nèi)、外均未見(jiàn)如此全方位、系統(tǒng)的近交系豬異體皮膚移植鑒定技術(shù)方法的報(bào)道。

2 建立了豬近交系鑒定基因組水平鑒定標(biāo)準(zhǔn)

據(jù)國(guó)內(nèi)、外研究報(bào)道，通過(guò)利用Illumina豬高密度SNP芯片(6萬(wàn)個(gè)SNPs)對(duì)豬、牛、雞、鼠等動(dòng)物遺傳資源進(jìn)行遺傳學(xué)評(píng)估與開(kāi)發(fā)利用已屢見(jiàn)不鮮，但用于近交系豬鑒定還未見(jiàn)報(bào)道。我國(guó)馮書(shū)堂等[3]，曾將此技術(shù)用于近交系豬F17～F22共6個(gè)世代的遺傳檢測(cè)研究，并以非近交系海南五指山豬為對(duì)照組，共計(jì)112個(gè)樣品，研究結(jié)果證明，分布于近交系18對(duì)常染色體上的50 418個(gè)有效SNPs中，該近交系群體F20SNPs已被固定的比例高達(dá)80.0%以上。隨著世代的推進(jìn)，幾乎在所有的染色體上都有一些區(qū)域有規(guī)律地被慢慢固定，雜合度由大到小直至為0，而非近交系海南五指山豬群體幾乎所有染色體區(qū)域均表現(xiàn)高度雜合，50 418個(gè)有效SNPs呈彌漫性、均勻性、無(wú)規(guī)律地分布于18個(gè)染色體上，發(fā)現(xiàn)了近交系豬“不純合”基因的遺傳現(xiàn)象，揭示了近交系豬群體基因雜合度均為1的分子遺傳特征。利用豬近交系鑒定基因組水平驗(yàn)證策略及手段，證明培育出的近交系是一種新的遺傳種質(zhì)資源，如圖1所示。

圖1 近交系WZSP與非近交系海南WZSP 1號(hào)染色體上50 418個(gè)SNPs的純合度分析(選自：遺傳，2016.28(3):178)Fig.1 Homozygosity analysis of 50 418 SNPs between the inbred lineWZSP and non-inbred line Hainan WZSP on Chr. 1

依據(jù)Illumina豬高密度SNP芯片分析結(jié)果，可將WZSP近交系與WZSP非近交系區(qū)分開(kāi)來(lái)，并提出了該近交系與非近交系 WZSP的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，已分別授權(quán)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(ZL201410152864.5；ZL201410562272.0； US9029090B2)等[13-15]。

3 建立了五指山小型豬近交系其他多種鑒定方法

據(jù)報(bào)道利用SNP位點(diǎn)分析、微衛(wèi)星標(biāo)記、特異性等位基因等對(duì)不同豬品種進(jìn)行遺傳分析已有多年并有許多報(bào)道[9，16-18]，已建立了多種近交系豬的鑒定方法：

3.1 同工酶蛋白質(zhì)鑒定研究[9]

在眾多的蛋白質(zhì)和微衛(wèi)星標(biāo)記中，以哪些標(biāo)記作為遺傳控制的標(biāo)準(zhǔn)？我國(guó)科學(xué)研究人員李奎等，參照前人在豬品種中做過(guò)的標(biāo)記位點(diǎn)，建立的方法，以及哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠和大鼠的位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，考察這些位點(diǎn)在染色體的分布。選擇可以代表實(shí)驗(yàn)用豬特點(diǎn)的6種標(biāo)記，如表1。

表1 蛋白質(zhì)標(biāo)記、染色體分布、組織來(lái)源Table 1 Protein markers, chromosomedistribution, tissue sources

蛋白質(zhì)標(biāo)記檢測(cè)采用了最常用的電泳方法，對(duì)該近交系與貴州小型豬、廣西巴馬小型豬比對(duì)，研究發(fā)現(xiàn)：依據(jù)三品系實(shí)驗(yàn)用小型豬在6個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)記等位基因頻率的分布差異性，發(fā)現(xiàn)AKP蛋白質(zhì)標(biāo)記AA型，可作為該近交系與貴州、廣西巴馬小型豬品系間鑒定方法之一[9]。

3.2 特異性微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記研究

我國(guó)馮書(shū)堂等報(bào)道[9]在微衛(wèi)星檢測(cè)、 選用微衛(wèi)星標(biāo)記研究中，選擇、提出21個(gè)具有通用性、多態(tài)豐富性、有效性：如下四個(gè)特點(diǎn)微衛(wèi)星位點(diǎn)，具有通用性：屬于美國(guó)豬基因組協(xié)作計(jì)劃推薦的第11組用于遺傳多樣性和親緣鑒定研究的微衛(wèi)星標(biāo)記。具有分布廣：選擇的21個(gè)位點(diǎn)在豬單倍體中的每條染色體中都有，且1號(hào)和3號(hào)染色體的兩個(gè)標(biāo)記分布于染色體的不同臂，這些引物在普通豬群的多態(tài)性都很好，等位基因數(shù)最少的為4；其中的14對(duì)標(biāo)記S0155、SW240、SW72、SW0227、S0005、S0228、S0101、S0355、SW911、SW951、S0386、S0090、SW769、SW857，研究證明被用來(lái)進(jìn)行奧地利豬種(長(zhǎng)白、皮特蘭和大白豬)的親子鑒定，其中10對(duì)引物進(jìn)行多重PCR的鑒定結(jié)果的可靠性都在99%以上。

研究所用S0155，CGA，SW240，S0005等21對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記，分別在1q、1q、2p、5q染色體位點(diǎn)上、分別具有6、12、8和10個(gè)等位基因數(shù)，研究表明，可以得到用于三個(gè)小型豬品種準(zhǔn)確分辨的座位有SW24，SW951,S0005,S0101，SW769，S0355，SW902，SW72，S0218，S0090，CGA。三個(gè)小型豬品種中特有等位基因共96個(gè)，其中貴州小型豬有49個(gè)，WZSP近交系有22個(gè)，廣西巴馬小型豬有25個(gè)，這些片段可以用作三個(gè)小型豬品種個(gè)體的遺傳鑒定。尤其S0005位點(diǎn)只wzsp近交系完全純合，可作為該近交系與貴州、廣西小型豬之間的鑒定標(biāo)準(zhǔn)與方法[9]。不同品種的豬的基因型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同品種豬的Pnas-4基因StyI多態(tài)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Polymorphism detection results of pnas-4 gene StyI in pigs of different breeds

結(jié)果表明，五指山小型豬近交系只存在CC基因型和C等位基因，而其它品種的豬存在T等位基因。該輔助鑒定五指山小型豬近交系的方法及其專(zhuān)用引物，已授權(quán)美國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(US9029090B2)[15]；此外，利用該近交系與貴州香豬、廣西巴馬小型豬比對(duì)研究，發(fā)現(xiàn)在SW24等10個(gè)基因座位上有22個(gè)特異等位基因，可做為三品種間的區(qū)別鑒定方法，亦可作為其鑒定方法[9]；SW936 位點(diǎn)以作為“五指山小型豬的一種分子標(biāo)記及其應(yīng)用”，已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(ZL200510008994.2)等遺傳特異性，均可以作為鑒定方法，把該近交系同其他品種豬區(qū)別開(kāi)來(lái)[19]。

4 異體皮膚移植技術(shù)是近交系最佳鑒定方法

研究表明，同工酶蛋白質(zhì)特異性鑒定研究，作為物種檢測(cè)遺傳特性的一種方法，是基于20世紀(jì)60年代蛋白電泳技術(shù)的出現(xiàn)而應(yīng)用。但是，蛋白和同工酶都是基因的表達(dá)產(chǎn)物，非遺傳物質(zhì)本身。蛋白電泳所檢測(cè)的主要是血漿和血細(xì)胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的變化，其測(cè)定結(jié)果易受檢測(cè)對(duì)象環(huán)境和發(fā)育狀況的影響，以及蛋白電泳檢測(cè)諸多條件的限制影響。因此，這些因素決定了蛋白電泳檢測(cè)技術(shù)數(shù)據(jù)具有一定的局限性，但由于蛋白電泳技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速及檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)低廉，目前仍是非近交系物種之間生化遺傳鑒定的方法之一。

特異性微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記研究，是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是 DNA 基因水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記鑒定方法——同工酶蛋白質(zhì)、形態(tài)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記[3]相比DNA遺傳標(biāo)記包括特異等位基因、SNP分析等鑒定技術(shù)[4-9]，DNA基因分子標(biāo)記等具有較高科學(xué)性，由于大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，不受生物發(fā)育階段、不同組織的影響；基因組變異極其豐富，基因分子標(biāo)記的數(shù)量多，但少量基因不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與性狀的主效基因連鎖性不強(qiáng)，使其有時(shí)應(yīng)需選擇多個(gè)檢測(cè)目的基因才能達(dá)到目的。其檢測(cè)手段具有快速、準(zhǔn)確性能高，是目前非近交系物種鑒定的方法之一，但因基因分子標(biāo)記鑒定程序需引物合成、測(cè)序需使用特殊儀器設(shè)備，相對(duì)而言技術(shù)復(fù)雜、且費(fèi)用高，尤其是豬高密度SNP芯片技術(shù)所需測(cè)定費(fèi)用更高，多數(shù)用于特殊情況下如法學(xué)等非近交系物種之間的鑒定。

異體皮膚移植應(yīng)是近交系動(dòng)物鑒定的最經(jīng)典、有效方法，是基于該近交系品種(或品系)是來(lái)源于非近交系種群，近交系雖是具有等位基因高度純合的特殊的遺傳群體，但其遺傳結(jié)構(gòu)基因幾乎100%來(lái)源于某培育它的非近交系一品種(或品系)。因此，他們具有共同的遺傳基礎(chǔ)，如特殊基因等，具有來(lái)源某一非近交系品種群體的特征和某些共同等位基因的群體。因此，利用上述同工酶蛋白質(zhì)、DNA遺傳標(biāo)記、特異等位基因等技術(shù)，可以鑒定該近交系與其他品種(或品系),但就很難利用此方法找出、提供其與來(lái)源某一品種群體不同的、量化指標(biāo)、令人信服的證據(jù)。由于科學(xué)發(fā)展到目前的局限性，還未建立起公認(rèn)的近交系高通量SNP技術(shù)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，所以利用高通量SNP技術(shù)手段，也難以提供量化指標(biāo)、令人信服的證據(jù)。

大量的研究結(jié)果已證明，近交系動(dòng)物基因高度純合、免疫抗原高度一致，其異體器官移植不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；而皮膚免疫排斥為典型的細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)，只有自體和同系皮膚移植才不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥[20]，又是排斥反應(yīng)最為直觀的器官。因此，利用異體皮膚移植鑒定近交系正是基于這兩大特點(diǎn)，可有效地把近交系同培育的來(lái)源供體品種(或品系)區(qū)別開(kāi)來(lái)、更能同其他品種區(qū)別開(kāi)來(lái)。

我國(guó)開(kāi)展的豬異體皮膚移植未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，不僅驗(yàn)證近交系培育成功，也為大型哺乳動(dòng)物近交系鑒定，提供科學(xué)的檢測(cè)技術(shù)和方法，包括：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)試月齡、皮膚移植面大小、觀測(cè)方法與時(shí)間、外周血項(xiàng)因子測(cè)定等，一整套系統(tǒng)技術(shù)方法與數(shù)據(jù)[10]。截至目前，利用異體皮膚移植技術(shù)，全方位、系統(tǒng)的鑒定近交系豬，國(guó)內(nèi)、外均未見(jiàn)報(bào)道。

5 提出近交系豬5條鑒定標(biāo)準(zhǔn)(草案)

基于上述研究與分析，中國(guó)農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所科研人員，2013年在農(nóng)業(yè)部組織的“五指山小型豬近交系培育成功”專(zhuān)家鑒定會(huì)上，提出了“提出近交系豬6條鑒定標(biāo)準(zhǔn)”(草案)。在國(guó)家科技部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)家委員會(huì)多位專(zhuān)家參于下，依據(jù)國(guó)際有關(guān)嚙齒類(lèi)近交系鼠類(lèi)的規(guī)定和近交系鼠的遺傳監(jiān)測(cè)方法，基于該近交系豬種質(zhì)和分子遺傳特異性，修改為5條鑒定標(biāo)準(zhǔn)(草案)刊登在《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)》[21]。

上述標(biāo)準(zhǔn)(草案)的提出，將為我國(guó)創(chuàng)新資源近交系豬培育和開(kāi)發(fā)利用奠定科學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)為我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的近交系小型豬新品系提供技術(shù)保障，無(wú)疑將促進(jìn)我國(guó)人類(lèi)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，并使我國(guó)大型哺乳動(dòng)物近交系研究處于國(guó)際領(lǐng)先地位。