李登科 彭贊平 陳科潔 吳端生 王余德

(1. 南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，衡陽(yáng) 421001)(2. 岳陽(yáng)市婦幼保健院，岳陽(yáng) 414000)(3. 南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，衡陽(yáng) 421001) (4.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院省部共建淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410006)

隨著人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)中的電離輻射日趨增加，人類(lèi)受到來(lái)自各方面輻射的威脅，故加強(qiáng)輻射生物效應(yīng)研究很有意義。輻射可直接誘導(dǎo)機(jī)體自由基ROS的產(chǎn)生，自由基與DNA相互作用可誘導(dǎo)遺傳損傷[1]，導(dǎo)致基因突變、致癌和細(xì)胞凋亡[2]，影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，還可通過(guò)增加自由基的形成來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。而肝臟、腎臟作為機(jī)體高度代謝活躍的器官，易受到氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能受到損害。本實(shí)驗(yàn)室培育了標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)紅鯽[4]，在探討實(shí)驗(yàn)紅鯽應(yīng)用過(guò)程中，嘗試過(guò)實(shí)驗(yàn)紅鯽應(yīng)用于輻射生物效應(yīng)的研究[5]。本文旨在報(bào)道137Cs輻照對(duì)實(shí)驗(yàn)紅鯽肝、腎組織HSP70表達(dá)的影響，并探討人參煎劑對(duì)實(shí)驗(yàn)紅鯽的輻射防護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)及馴化

實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系，80尾，雌雄各半，體長(zhǎng)為(11.5±0.9)cm，體質(zhì)量(64.2±1.6)g，均由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。實(shí)驗(yàn)紅鯽馴養(yǎng)于水族箱中，采用曝氯2 d的自來(lái)水，馴養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)，水溫維持(18±2)℃，pH值(6.48±0.3)，溶氧量(6.28±0.5)mg/L。實(shí)驗(yàn)期間，按常規(guī)投喂維持飼料，并用增氧泵持續(xù)充氧。

1.2 主要試劑及儀器

藥用人參切片購(gòu)于長(zhǎng)白林寶公司；BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒及?-actin一抗購(gòu)于碧云天公司；HSP70一抗購(gòu)于Abcam公司；HSP70二抗及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于康為生物試劑公司。

HXFS-IA生物輻照儀：中國(guó)核工業(yè)集團(tuán)；高速冷凍離心機(jī)：THERMO公司；凝膠成像系統(tǒng)：Tanon公司；半干/濕轉(zhuǎn)膜儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1人參煎劑制備：稱(chēng)取500 g人參切片，將人參加雙蒸水浸泡30 min后放于熬制罐中，加入蒸餾水，文火熬制三次，每次熬制1 h，收集三次人參煎劑濃縮至500 mL，制成1 g/mL人參煎劑后用過(guò)濾除菌法滅菌，4 ℃保存待用。人參煎劑給藥方式為：加濃縮液至養(yǎng)殖水中稀釋藥液濃度至0.1 g/L后，投放實(shí)驗(yàn)魚(yú)浸浴其中。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及處理：實(shí)驗(yàn)分組及處理，如表1，分別解剖實(shí)驗(yàn)紅鯽3尾，提取肝臟、腎臟用于HSP70表達(dá)量的測(cè)定。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)處理Table 1 Group of Experiments and experimental treatment

輻照處理組均用HXFS-IA生物輻照儀以不同劑量的137Cs一次性輻照。即：將實(shí)驗(yàn)紅鯽個(gè)體放置在HXFS-IA生物輻照儀輻射室內(nèi)自動(dòng)旋轉(zhuǎn)的金屬載物筒內(nèi)，魚(yú)體距離輻射源頭約150 mm，通過(guò)調(diào)節(jié)輻照時(shí)間，輻照儀則自動(dòng)設(shè)定輻射劑量率。

1.3.3HSP70蛋白表達(dá)量的測(cè)定：肝臟、腎臟組織經(jīng)勻漿機(jī)研磨后，裂解離心提取總蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白含量。用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠80 V，30 min；分離膠110 V，80 min)，濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜(300 mA，2h)，用5%脫脂奶粉常溫下封閉2 h；加入一抗HSP70(1∶1 000稀釋)以及β-actin (1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶3 000稀釋)室溫下孵育1 h，經(jīng)洗滌、顯影拍照后用軟件ImageJ分析目的條帶及內(nèi)參β-actin條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析，以P<0.05認(rèn)為差異有顯著性，并用GraphPad Prism5軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟HSP70蛋白表達(dá)量變化

實(shí)驗(yàn)紅鯽經(jīng)137Cs輻照及人參煎劑給藥處理后，分別于第14、28天取樣檢測(cè)實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟中HSP70的表達(dá)量，結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖可知，1組和2組的Hsp70的蛋白表達(dá)量，無(wú)論第14天還是第28天，差異較小，提示單一的人參煎劑處理對(duì)肝臟HSP70表達(dá)無(wú)明顯影響。經(jīng)分析1組、3組和6組的Hsp70表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)137Cs輻射可引起HSP70表達(dá)量的升高，且隨輻射劑量和輻射時(shí)間的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分別比較分析3組、4組、5組和6組、7組、8組，發(fā)現(xiàn)4組、5組的HSP70表達(dá)量比3組有較大幅度的下降，7組、8組的HSP70表達(dá)量比6組有較大幅度的下降，差異均顯著(P<0.05)，表明將人參煎劑用于預(yù)防或治療均可抑制輻射所致實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟HSP70表達(dá)的上升；分別比較4組、5組和7組、8組，發(fā)現(xiàn)人參煎劑用做預(yù)防或治療處理時(shí)，兩者之間的HSP70表達(dá)量均無(wú)明顯差異。

圖1 第14天實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟HSP70表達(dá)量注：與4.1Gy輻照組比較，*P<0.05；與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.1 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp liver at day 14Note: Compared with 4.1Gy group, *P<0.05; Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

圖2 第28天實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟HSP70表達(dá)量注：與4.1Gy輻照組比較，*P<0.05；與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.2 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp liver at day 28Note: Compared with 4.1Gy group, *P<0.05; Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

2.2 實(shí)驗(yàn)紅鯽腎臟HSP70蛋白表達(dá)量變化

不同實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)紅鯽腎臟組織HSP70表達(dá)量，如圖3和圖4所示。由圖3和圖4經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知，在137Cs 輻照后第14天，實(shí)驗(yàn)紅鯽腎臟HSP70的表達(dá)量，輻照組的均顯著高于對(duì)照組、預(yù)防組和治療組的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在經(jīng)137Cs輻照后第28天，4.1Gy輻照組的實(shí)驗(yàn)紅鯽腎臟HSP70表達(dá)量顯著高于對(duì)照組的(P<0.05)，但與預(yù)防組和治療組的相比，差異均不明顯(P>0.05)；8.2Gy輻照組的實(shí)驗(yàn)紅鯽腎臟HSP70表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組的和治療組的(P<0.05)，但與預(yù)防組的相比，無(wú)明顯差異(P>0.05)。分別比較3組、4組和7組、8組，同樣發(fā)現(xiàn)人參煎劑做預(yù)防或治療處理，兩者之間的HSP70表達(dá)量均無(wú)明顯差異。

綜合以上結(jié)果表明，137Cs輻照均能使實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟和腎臟HSP70蛋白表達(dá)量升高，人參煎劑對(duì)正常實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟和腎臟HSP70表達(dá)的影響不明顯，但人參煎劑能夠預(yù)防或抑制因137Cs輻照而引起的實(shí)驗(yàn)紅鯽肝臟和腎臟HSP70蛋白表達(dá)量的升高。

圖3 第14天實(shí)驗(yàn)紅鯽腎臟HSP70表達(dá)量注：與4.1Gy輻照組比較，*P<0.05；與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.3 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp kidney at day 14Note: Compared with 4.1Gy group, *P<0.05; Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

圖4 第28天實(shí)驗(yàn)紅鯽腎臟HSP70表達(dá)量注：與8.2Gy輻射組比較，#P<0.05Fig.4 The expression of HSP70 in the laboratoryred crucian carp kidney at day 28Note: Compared with 8.2Gy group, #P<0.05

3 討論

3.1 HSP70及功能

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)屬于熱應(yīng)激反應(yīng)性蛋白，是一種保護(hù)性蛋白。它在細(xì)胞中執(zhí)行最基本的生理功能，以維持細(xì)胞的生存和功能，在應(yīng)激的不利條件下，提高細(xì)胞的抵抗力，起到應(yīng)激保護(hù)作用[6]。HSP具有分子伴侶的作用，保護(hù)蛋白質(zhì)免受損害或重新折疊有缺陷的多肽，以試圖恢復(fù)其天然構(gòu)象[7]。由于HSP家族不同成員的合成會(huì)響應(yīng)各類(lèi)不同應(yīng)激源而表達(dá)，包括極端生理、環(huán)境和病理的損害，故有人提出熱休克蛋白可作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的一般生物標(biāo)志物[8]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，魚(yú)類(lèi)經(jīng)常遭受高溫，水質(zhì)差，細(xì)菌和病毒侵襲，造成機(jī)體與環(huán)境之間的平衡失調(diào)，引起魚(yú)類(lèi)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)[9]。HSP70作為HSP家族中的成員之一，能在應(yīng)激情況下迅速合成，并對(duì)應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)耐受作用，在響應(yīng)熱休克，免疫保護(hù)，寄生蟲(chóng)感染等應(yīng)激條件中發(fā)揮重要作用[10-11]。

3.2 137Cs輻射與HSP70表達(dá)

研究資料表明，生物暴露于輻射環(huán)境中可引起體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基ROS(O2-、H2O2及HO2·、·OH等)，而使細(xì)胞或組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)HSP70的大量合成而使細(xì)胞減弱氧化應(yīng)激傷害[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)紅鯽經(jīng)137Cs輻照后肝臟及腎臟中HSP70表達(dá)水平均有顯著上升，且存在一定的量效關(guān)系。HSP70可通過(guò)多種途徑減少輻射對(duì)組織和器官的損傷，可直接抑制ROS產(chǎn)生依賴(lài)的NADPH氧化酶的活性，并能控制蛋白復(fù)合物的正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝和拆卸，維持細(xì)胞的正常生理功能[13-14]。有研究表明，通過(guò)用紫草紅處理人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞，使HSP70過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HSP70不僅能干擾半胱天冬酶活化以阻斷細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)抑制NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)減少促炎細(xì)胞因子(如IL-1b)的產(chǎn)生，起到抗炎作用[15]。此外，HSP70的輻射防護(hù)潛力還與其免疫調(diào)節(jié)能力有關(guān)[16]。這些都說(shuō)明HSP70在調(diào)節(jié)細(xì)胞輻射損傷的修復(fù)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

3.3 人參抗輻射氧化損傷

人參對(duì)輻射所致機(jī)體損傷的保護(hù)作用已有文獻(xiàn)報(bào)道[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，實(shí)驗(yàn)紅鯽在經(jīng)4.1 Gy和8.2 Gy輻照后，HSP70的表達(dá)量增加，說(shuō)明HSP70具有抗氧化應(yīng)激的作用，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，經(jīng)人參煎劑處理(預(yù)防或治療)的實(shí)驗(yàn)紅鯽肝、腎HSP70的表達(dá)量均顯著下降，提示人參煎劑具有抗輻射氧化損傷的作用。已有的研究表明, 人參煎劑抗輻射氧化損傷的機(jī)理可能與人參皂甙的藥效有關(guān)。人參皂甙是人參發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)，可通過(guò)清除機(jī)體產(chǎn)生的多余自由基發(fā)揮其抗氧化能力，具有抗炎，輻射防護(hù)，抗應(yīng)激，免疫調(diào)節(jié)，抗疲勞和抗腫瘤等特性[18-19]。此外，人參可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)輻射致肝損傷的保護(hù)作用[20]。本實(shí)驗(yàn)中，在8.2Gy137Cs輻照實(shí)驗(yàn)紅鯽后第28天時(shí)輻照組腎臟HSP70表達(dá)量與預(yù)防組、治療組的差異不明顯，可能是人參藥效減弱所致；而肝臟HSP70表達(dá)量均高于預(yù)防組和治療組的HSP70表達(dá)量，可能是由于人參皂甙在實(shí)驗(yàn)紅鯽體內(nèi)的肝腸循環(huán)使肝臟仍有一定的藥物濃度。

3.4 實(shí)驗(yàn)紅鯽應(yīng)用于輻射生物效應(yīng)研究

實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系是南華大學(xué)吳端生教授研究團(tuán)隊(duì)近年來(lái)培育的中國(guó)本土的實(shí)驗(yàn)魚(yú)類(lèi)近交系，具有應(yīng)用于毒理學(xué)研究和環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的許多優(yōu)點(diǎn)[21]，在輻射生物效應(yīng)方面曾做過(guò)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)紅鯽經(jīng)137Cs輻照1.92Gy劑量即可出現(xiàn)血液生理生化指標(biāo)的改變，相當(dāng)于人類(lèi)的0.5Gy輻照劑量，表現(xiàn)為肝臟、腎臟、腦及心臟等不同程度的損傷，且存在著一定的“劑量-時(shí)間-效應(yīng)”關(guān)系[5]。2016年12月，湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布了《實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系遺傳質(zhì)量控制》地方標(biāo)準(zhǔn)[4]。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，作者認(rèn)為實(shí)驗(yàn)紅鯽作為輻射生物效應(yīng)研究的模式動(dòng)物是可行的。