李 想 向紹杰 趙 磊 關(guān)敬之 齊 越 孟 莉丁春曉 喬菊久 甘 雨 劉小虎

(1. 遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng) 110042)(2. 遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽(yáng) 110034)(3. 內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院,呼和浩特 010065)

特異性心肌病是指病因明確的心肌疾病,這些病稱為特異性心肌疾病。特異性心肌病，包括缺血性心肌病、高血壓心肌、瓣膜性心肌病、代謝性心肌炎病、癥性心肌病等。缺血性心肌病表現(xiàn)為擴(kuò)張型心肌病伴收縮功能損傷而不能以冠狀動(dòng)脈病變或缺血損傷的范圍來(lái)解釋[1]。瓣膜性心肌病表現(xiàn)為心室功能障礙而超過(guò)了其異常負(fù)荷。高血壓性心肌病常表現(xiàn)為左心室肥大伴擴(kuò)張型和心力衰竭的特點(diǎn)。異丙腎上腺素對(duì)β受體有較強(qiáng)的激動(dòng)作用，過(guò)量時(shí)因增加心肌收縮力和耗氧量，可引起心律失常甚至心肌缺血壞死[2]。本研究經(jīng)皮下多點(diǎn)注射不同天數(shù)異丙腎上腺素(1 mg/kg)誘發(fā)大鼠特異性心肌病，通過(guò)大鼠心肌組織切片HE染色、免疫組化檢測(cè)VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)表達(dá)以及心電圖T波的變化確定最佳的造模時(shí)間，為后續(xù)藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

鹽酸異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)41160302)。VEGFA Polyclonal Antibody (Elabscience Biotechnology CO.,Ltd,Catalog No:EGM0307)。FGF2 Polyclonal Antibody (Elabscience Biotechnology CO.,Ltd,Catalog No:ESAP12457)。DAB濃縮型試劑盒(Beijing Solarbio Science & Technology CO.,Ltd,20170419)。PBS磷酸緩沖液(Solarbio,20170531)。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量l80～200 g，SPF級(jí)，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

1.3 儀器

ML785型多道生理記錄儀，澳大利亞AD公司生產(chǎn)；光電顯微鏡：奧林巴斯中國(guó)有限公司生產(chǎn)，BX53型；電熱恒溫培養(yǎng)箱：廈門醫(yī)療電子儀器廠生產(chǎn)，JKDP2型；TP1020自動(dòng)脫水機(jī)，德國(guó)(徠卡)生產(chǎn)；YG-280KX攤片機(jī)，湖北孝感市陽(yáng)光神琦醫(yī)用科技有限公司；YG-280KX烤片機(jī)，湖北孝感市陽(yáng)光神琦醫(yī)用科技有限公司；Leica切片機(jī)，德國(guó)(徠卡)生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1特異性心肌病模型的建立[3-6]

將SD大鼠90 只適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，所有大鼠用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg體質(zhì)量)麻醉，測(cè)基礎(chǔ)心電圖。剔除心電圖異常大鼠10只，然后抽取80只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素(1 mg/kg)2 d組、4 d組、6 d組，每組20只。除空白對(duì)照組外各組大鼠腹腔注射異丙腎上腺素(1 mg/kg)[3-7]。分別于皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素(1 mg/kg·d-1)2 d、4d、6 d后停止注射，于首次注射異丙腎上腺素后第13天在各組存活的大鼠中隨機(jī)抽取10只用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，測(cè)心電圖，迅速處死大鼠，取下心臟，用4%甲醛溶液固定，取左心室心尖，進(jìn)行HE染色，并通過(guò)免疫組化法檢測(cè)心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在心肌細(xì)胞的表達(dá)。

1.4.2HE染色心臟病理分級(jí)

0級(jí)，正常心肌，無(wú)病變；1級(jí)，局灶性的間質(zhì)反應(yīng)；2級(jí)，多處局灶性損害，心室有散在小灶性壞死及條索狀壞死，肌纖維腫脹和斷裂；3級(jí)，退行性損害伴隨玻璃樣壞死、肌纖維斷裂以及水腫，部分心肌細(xì)胞溶解消失，中性白細(xì)胞浸潤(rùn)，右心室亦有灶性壞死；4級(jí)，左心室片狀透壁壞死，心肌細(xì)胞溶解消失，肉芽組織增生，呈片狀淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性白細(xì)胞浸潤(rùn)，右心室亦有灶性壞死。HE積分平均值等于每組大鼠心臟病理分級(jí)之和除以每組大鼠動(dòng)物數(shù)。

1.4.3免疫組織化學(xué)染色

按照DBA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行免疫組化染色，心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體稀釋比例為1∶300，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體稀釋比例為1∶200，觀察左心室心肌細(xì)胞的病理變化，并使用ImageJ軟件對(duì)免疫組化染色病理切片進(jìn)行半定量分析，計(jì)算相對(duì)光密度值(A)。A=log[gv0/gv)](gv0 為背景區(qū)灰度值， gv 為陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域灰度值)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0軟件處理，計(jì)量資料滿足正態(tài)性和方差齊性者進(jìn)行方差分析，以P﹤0.05或0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠心電圖T波變化的結(jié)果

注射異丙腎上腺素6 d組與空白對(duì)照組T波具有顯著性差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)心電圖T波變化的影響Table 1 Influence of T-wave changes in

注：★與空白對(duì)照組比較P<0.05，T波變化：F=4.50。T波變化值=造模前T波值-造模后T波值

Note:★was compared with the blank control groupP<0.05, T- wave change: F=4.50. T-wave change value=pre-modelling T-wave value-post-modelling T-wave value

2.2 大鼠心肌細(xì)胞HE染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

注射異丙腎上腺素4 d組、異丙腎上腺素6 d組HE染色積分平均值與空白對(duì)照組比，具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。異丙腎上腺素4 d組、異丙腎上腺素6 d組VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)表達(dá)相對(duì)光密度值與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)。異丙腎上腺素6 d組FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)表達(dá)相對(duì)光密度值與空白對(duì)照組比，具有顯著性差異(P<0.01)，見(jiàn)表2、圖1、圖2、圖3。

表2 心肌細(xì)胞HE染色及免疫組織化學(xué)染色Table 2 HE staining and immunohistochemical staining of myocardial

注：★與空白對(duì)照組比較P<0.05，★★與空白對(duì)照組比較P<0.01。F=9.53，F(xiàn)=12.72，F(xiàn)=12.64

Note:★Compared with the blank control groupP<0.05,★★Compared with the blank control groupP<0.01. F=9.53，F(xiàn)=12.72，F(xiàn)=12.64

圖1 心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining of myocardial cells

圖2 VEGF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 VEGF activity in myocardial cells

圖3 FGF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 FGF activity in myocardial cells

3 討論

T波位于S-T段之后，是心室復(fù)極所產(chǎn)生的，鈍圓，占時(shí)較長(zhǎng)，從基線緩慢上升，然后較快下降，形成前肢較長(zhǎng)、后肢較短的波形。正常T波方向常和QRS波群的主波方向一致。在QRS波群主波向上的導(dǎo)聯(lián)中，T波倒置或低平，常見(jiàn)于心肌缺血[7]。心肌缺血的心電圖改變類型取決于缺血的發(fā)生部位、持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度。具有特異性的心肌缺血發(fā)作時(shí)，面向缺血部位的導(dǎo)聯(lián)常顯示缺血型ST段壓低或T波倒置[8]。本研究結(jié)果表明隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，T波變化值逐漸變大，造模6 d后T波變化值與空白對(duì)照組具有顯著性差異，T波低平或倒置，揭示心肌缺血模型造模成功。

缺血性心肌病指由于長(zhǎng)期心肌缺血導(dǎo)致心肌彌漫性纖維化等一系列表現(xiàn)的臨床綜合征，是心肌供氧量不足以滿足心肌的需氧量，使血氧供需失衡引起的一種結(jié)果。異丙腎上腺素對(duì)β受體作用較強(qiáng)；過(guò)量時(shí)因增加心肌收縮力及耗氧量，引起心律失常和心肌缺血壞死。大鼠經(jīng)皮下反復(fù)給予過(guò)量的異丙腎上腺素可引起心肌耗氧量增加，從而引起供氧和需氧之間的不平衡導(dǎo)致心肌細(xì)胞變性和壞死，進(jìn)而引起心肌纖維化心肌瘢痕形成。由HE染色可見(jiàn)，正常心肌，無(wú)病變，隨著注射異丙腎上腺素時(shí)間的增加，心肌細(xì)胞損傷程度逐漸加重，注射異丙腎上腺素2 d組可見(jiàn)局灶性的間質(zhì)反應(yīng)；注射異丙腎上腺素4 d組可見(jiàn)多處局灶性損害，心室有散在小灶性壞死及條索狀壞死，肌纖維腫脹和斷裂；注射異丙腎上腺素6 d組出現(xiàn)部分心肌細(xì)胞溶解消失，中性白細(xì)胞浸潤(rùn)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子通過(guò)提高血漿酶原活化因子和血漿酶原活化因子抑制因子-l的mRNA表達(dá)，來(lái)提高血漿酶原活化因子的活性，能夠促進(jìn)細(xì)胞外蛋白水解，然后促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成[9]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可通過(guò)細(xì)胞小囊泡器增加血管通透性，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是最強(qiáng)的可增加血管通透性的因子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)血漿蛋白溶酶原激活物和血漿溶酶原激活物抑制劑-1，以及基質(zhì)膠原酶、誘導(dǎo)組織因子等在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。在動(dòng)物和成人的正常心肌細(xì)胞也有低水平表達(dá)，當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血缺氧受到損傷時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生因此表達(dá)增加。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)在動(dòng)脈粥樣硬化病灶中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的游走和平滑肌細(xì)胞的增殖，還可以促進(jìn)新血管形成，修復(fù)受損害的內(nèi)皮細(xì)胞[10-12]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一直被認(rèn)為是病灶形成促進(jìn)因子，但其又可加強(qiáng)左心室厚度，增強(qiáng)心肌彈性力，防止在血管壁沉積，治療血栓。因此在心肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)也會(huì)增加。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知隨著注射異丙腎上腺素天數(shù)延長(zhǎng)VEGF和FGF表達(dá)也在逐漸增加，注射異丙腎上腺素4 d組、異丙腎上腺素6 d組VEGF表達(dá)與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異。注射異丙腎上腺素6 d組FGF表達(dá)與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異。

本研究結(jié)果表明隨著皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠特異性心肌病所引起的心肌缺血更加顯著，表現(xiàn)為心電圖T波低平或倒置，與空白對(duì)照組比異丙腎上腺素6 d組HE染色、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)表達(dá)均具有顯著性差異，因此大鼠連續(xù)皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素(1 mg/kg·d-1)6 d以上可以作為特異性心肌病藥效評(píng)價(jià)的可靠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型使用。