楊 濤，周明菊，李華杰，黃輝煌，徐若男，施 明

自1981年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)HIV-1以來(lái)，目前針對(duì)HIV-1感染的治療方案中，聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（combination antiretroviral therapy, cART）的效果明確，使艾滋病逐漸轉(zhuǎn)變成慢性疾病。但HIV感染后過(guò)度的免疫活化和持續(xù)的炎癥反應(yīng)很難通過(guò)cART得到有效逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為艾滋病相關(guān)和非相關(guān)事件頻發(fā)[1]。cART可幫助患者免疫重建，恢復(fù)CD4+T細(xì)胞數(shù)量，但CD8+T細(xì)胞數(shù)量居高不下，導(dǎo)致CD4/CD8比值不能復(fù)常[2]。目前研究顯示，CD8+T細(xì)胞、CD4/CD8比值均應(yīng)作為評(píng)估機(jī)體免疫功能的指標(biāo)。尤其是CD4/CD8比值與機(jī)體過(guò)度的炎癥反應(yīng)和免疫超活化密切相關(guān)[3-6]。CD4/CD8比值復(fù)常是一個(gè)非常緩慢的過(guò)程，越早開(kāi)始cART（CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)高），CD4/CD8復(fù)常相對(duì)越容易[7]。而除了CD4+T細(xì)胞的基線水平外，機(jī)體中可能還存在其他的免疫因素能夠影響CD4/CD8比值復(fù)常[6]。

外泌體存在于關(guān)節(jié)滑液、母乳、血液等體液中，介導(dǎo)細(xì)胞間核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等生物活性分子的交換，從而影響受體細(xì)胞或親本細(xì)胞中的各種生理和病理過(guò)程。外泌體具有抗原遞呈功能，可以攜帶或遞呈主要組織相容性復(fù)合體-抗原復(fù)合物來(lái)調(diào)控抗原特異性CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[8-9]。在HIV感染過(guò)程中，外泌體既能保護(hù)機(jī)體免受病毒感染，又可增強(qiáng)HIV的感染能力[10-14]。已有研究證明外泌體可調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞功能[15-17]。本研究擬探討HIV-1慢性感染者接受長(zhǎng)期有效cART后的完全應(yīng)答（complete response, CR）患者血漿中外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞的潛在作用，及其與CD4/CD8比值的關(guān)系，闡述外泌體與HIV感染者炎癥反應(yīng)、持續(xù)免疫活化的關(guān)系，為艾滋病的臨床治療提供新的研究思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 納入2018年2—10月于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心愛(ài)心門診隨訪的HIV-1慢性感染且接受長(zhǎng)期有效cART的 CR患者19例。根據(jù)CD4/CD8比值將患者分為異常組（CD4/CD8＜0.8）10例和復(fù)常組（CD4/CD8＞0.8）9例。入組標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)《中國(guó)艾滋病診療指南（2018版）》[18]，入組HIV-1慢性感染的CR患者為接受cART 2年以上，血漿病毒載量持續(xù)2年以上低于檢測(cè)下限（20 copies/ml）， CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＞ 350個(gè)/μl。排除標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)前存在機(jī)會(huì)性感染；②合并HBV或者HCV等其他病毒感染；③妊娠期婦女或產(chǎn)褥期婦女；④患有精神類疾病或其他嚴(yán)重疾病患者。另以同期5例健康者作為健康對(duì)照（healthy control, HC）組。上述研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，其基本特征見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體的提取鑒定及粒徑分析 將患者血漿樣本解凍備用，依據(jù)血漿外泌體提取試劑盒要求提取血漿中的外泌體。電鏡檢測(cè)：滴加外泌體懸液至載樣銅網(wǎng)上，以2%磷鎢酸染液負(fù)染外泌體，電鏡下觀察外泌體形態(tài)。粒徑分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）：以PBS緩沖液稀釋外泌體，檢測(cè)外泌體粒徑和濃度，利用ZetaView 8.04.02軟件分析并記錄數(shù)據(jù)。Western blot鑒定：利用Jurkat細(xì)胞系作為對(duì)照，鑒定外泌體中標(biāo)志性蛋白CD63、TSG101和陰性標(biāo)志性蛋白GM130的表達(dá)。

表1 研究對(duì)象臨床資料Table 1 Clinical data of study subjects

1.2.2 細(xì)胞體外培養(yǎng) 獲取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），用含10%無(wú)外泌體血清的1640培養(yǎng)基重懸PBMC至合適濃度，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔添加100萬(wàn)細(xì)胞，各孔加入不同組患者的血漿外泌體，置于5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，2 h后加入CD3單抗（1 μg/ml）、CD28 單抗（1 μg/ml）和 IL-2細(xì)胞因子（200 IU/ml），培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞活化和胞內(nèi)因子水平。

1.2.3 細(xì)胞增殖效率檢測(cè) 獲取健康人PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度，用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（carboxy fl uorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE）標(biāo)記，無(wú)外泌體血清洗去多余染料后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取少量細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記效率，其余細(xì)胞分組與外泌體共培養(yǎng)，60 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖效率。

1.2.4 流式細(xì)胞染色 表型染色：收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，PBS洗滌后，加入CD4、CD8及CD38、HLA-DR抗體，避光孵育20 min，PBS洗滌后用1%多聚甲醛固定，24 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。胞內(nèi)因子染色：CD4、CD8表型染色后加入細(xì)胞破膜劑，混勻，4 ℃靜置40 min。破膜洗液洗滌后重懸細(xì)胞，加入IFN-γ、IL-2抗體，避光孵育20 min。破膜洗液洗滌細(xì)胞后用1%多聚甲醛固定，24 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用FlowJo_V10軟件對(duì)所有流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用GraphPad Prism 5.0繪制統(tǒng)計(jì)學(xué)圖形。定量資料符合正態(tài)分布用±s表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CR患者血漿外泌體的特性分析 在透射電子顯微鏡下能觀察到呈球狀或杯狀的血漿外泌體，可見(jiàn)明顯的封閉膜結(jié)構(gòu)，大小不一，直徑約100 nm（圖1A）。采用NTA檢測(cè)血漿外泌體的粒徑分布，結(jié)果顯示其顆粒分布較為集中，峰值約為85 nm（圖1B）。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示血漿外泌體表達(dá)CD63和TSG101，而不表達(dá)GM130（圖1C）。

圖1 血漿外泌體的鑒定Figure 1 Identification of plasma exosomes

2.2 各組血漿中外泌體的粒徑分布與濃度 利用NTA技術(shù)檢測(cè)了3組受試者（每組各5例）血漿中的外泌體濃度，發(fā)現(xiàn)3組間外泌體濃度有差異，異常組患者血漿中外泌體濃度顯著高于復(fù)常組（U=0，P=0.008）和HC組（U=2.000，P=0.032）（表2）。CR患者血漿外泌體的濃度與CD4/CD8比值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.648，P=0.043）（圖2）。

表2 各組外泌體濃度比較（×1011顆粒數(shù)/ml）Table 2 Comparison of exosome concentration in different groups(×1011 particles/ml)

2.3 CR患者血漿外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響

圖2 血漿外泌體濃度與CR患者CD4/CD8比值的相關(guān)性Figure 2 Correlation between the concentration of plasma exosomes and the CD4/CD8 ratio in CR patients

2.3.1 CR患者血漿外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞活化的影響 將不同組受試者外泌體（異常組10例，復(fù)常組9例，HC組5例）與健康人PBMC共培養(yǎng)，檢測(cè)外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞上的CD38和HLA-DR分子的共表達(dá)的影響。結(jié)果表明3組外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞活化水平的影響有顯著差異，異常組CD8+T細(xì)胞表面CD38+HLA-DR+的共表達(dá)水平明顯低于復(fù)常組（U=13.500，P=0.008）和HC組（U=1.000，P=0.001）（表3）。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示，CD8+T細(xì)胞的活化水平與CR患者CD4/CD8比值呈正相關(guān)（r=0.478，P=0.039）（圖3）。

表3 外泌體對(duì)CD8+ T細(xì)胞活化水平的影響（%）Table 3 Effects of plasma exosomes on the activation of CD8+ T cells(%)

圖3 CD8+ T細(xì)胞活化水平與CR患者CD4/CD8比值的相關(guān)性Figure 3 Correlation between the activation of CD8+ T cells and the CD4/CD8 ratio in CR patients

2.3.2 CR患者血漿外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 通過(guò)對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，檢測(cè)CD8+T細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ、IL-2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的影響有顯著差異，異常組CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力弱于復(fù)常組（U=17.000，P=0.022）和HC組（U=1.000，P=0.001）；此外，異常組CD8+T細(xì)胞分泌IL-2的能力也弱于復(fù)常組（U=8.500，P=0.001）和HC組（U=4.000，P=0.008）（表4）。CD8+T細(xì) 胞分泌IFN-γ和IL-2的水平與CR患者CD4/CD8比值均有顯著相關(guān)性（r=0.654，P=0.002；r=0.700，P＜0.001）（圖4）。

表4 外泌體對(duì)CD8+ T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響（%）Table 4 Effects of plasma exosomes on the secretion of cytokines from CD8+ T cells(%)

2.3.3 CR患者血漿外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖的影響 3組受試者的外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖水平的影響有顯著差異，異常組外泌體處理的CD8+T細(xì)胞增殖能力弱于復(fù)常組（U=0.000，P＜0.001）和HC組（U=3.000，P=0.005）（表5）。CD8+T細(xì)胞增殖能力與CR患者的CD4/CD8比值呈顯著正相關(guān)（r=0.716，P＜0.001）（圖5）。

3 討 論

CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)是臨床評(píng)估艾滋病進(jìn)展和疾病狀態(tài)最重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)，但是該指標(biāo)不能全面評(píng)估HIV感染者體內(nèi)免疫過(guò)度激活的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于CR患者，CD4/CD8比值的高低與疾病發(fā)生進(jìn)展、機(jī)體慢性炎癥和免疫活化密切相關(guān)[3-6]。但目前還不清楚是否存在獨(dú)立于cART之外的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)分子以對(duì)抗機(jī)體過(guò)度的炎癥反應(yīng)。

外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)和物質(zhì)交流的重要載體，其釋放受機(jī)體復(fù)雜炎癥環(huán)境的影響，同時(shí)可以影響機(jī)體的免疫微環(huán)境，對(duì)疾病進(jìn)程產(chǎn)生重要影響[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)CD4/CD8比值異常的CR患者體內(nèi)外泌體的濃度明顯高于CD4/CD8比值復(fù)?；颊?，且與CD4/CD8比值呈負(fù)相關(guān)。隨著CD4/CD8的復(fù)常，外泌體的濃度也明顯降低到接近HC水平。由此推測(cè)CD4/CD8異常患者體內(nèi)的慢性炎癥狀態(tài)可能是導(dǎo)致血漿中的外泌體水平升高的重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于CD4/CD8比值異常HIV感染者的血漿外泌體與CD8+T細(xì)胞體外共孵育時(shí)，CD8+T細(xì)胞的活化水平降低，CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2的能力均受到了抑制，且CD8+T細(xì)胞的增殖功能明顯減弱，說(shuō)明CD4/CD8比值異常的HIV感染者體內(nèi)升高的外泌體水平對(duì)機(jī)體過(guò)度的免疫活化和炎癥發(fā)揮抑制效應(yīng)，但是其表達(dá)水平升高的主動(dòng)性和被動(dòng)性值得我們思考。

此前對(duì)外泌體在HIV-1感染中作用的研究主要聚焦于未受感染細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)HIV-1感染的抑制，以及感染細(xì)胞來(lái)源的外泌體增強(qiáng)病毒感染的能力[10-14]。關(guān)于外泌體在接受長(zhǎng)期有效cART患者免疫重建過(guò)程中所發(fā)揮作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果提示，在CD4/CD8比值異常的HIV感染者體內(nèi)，血漿外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞發(fā)揮了較強(qiáng)的免疫抑制效應(yīng)。近期一些研究表明，對(duì)免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以分泌具有類似功能的外泌體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，形成免疫抑制性環(huán)境[21-22]。在HIV感染過(guò)程中，外泌體作為重要的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和功能分子，在抑制CD8+T細(xì)胞的功能方面發(fā)揮重要作用，可能是機(jī)體應(yīng)對(duì)過(guò)夠反映經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期cART的患者體內(nèi)免疫平衡是否恢復(fù)良好。依據(jù)現(xiàn)有的結(jié)果，可以在后續(xù)研究中進(jìn)行驗(yàn)證和擴(kuò)展，以利用血漿外泌體作為cART后相關(guān)免疫恢復(fù)的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，為艾滋病的功能性治愈提供新的研究思路。本研究不足之處在于入組患者例數(shù)較少，后續(xù)研究有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。HIV感染者血漿中存在來(lái)自各種組織細(xì)胞的許多外泌體亞群，如何區(qū)分患者樣品中不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體是最主要的挑戰(zhàn)，后期的研究將探討各種未解決的問(wèn)題。度免疫活化和炎癥反應(yīng)的自身負(fù)反饋效應(yīng)分子。借助自身的主動(dòng)或者被動(dòng)性高表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制CD8+T細(xì)胞過(guò)度活化增殖的目的，但其具體效應(yīng)機(jī)制仍須深入研究。

圖4 CD8+ T細(xì)胞分泌因子水平與CR患者CD4/CD8比值的相關(guān)性A. CD8+ T細(xì)胞分泌IFN-γ水平與患者CD4/CD8比值之間的相關(guān)性分析； B. CD8+ T細(xì)胞分泌IL-2水平與患者CD4/CD8比值之間的相關(guān)性分析Figure 4 Correlation between the secretion of cytokines from CD8+ T cells and the CD4/CD8 ratio in CR patients

表5 外泌體對(duì)CD8+ T細(xì)胞增殖的影響（%）Table 5 Effects of plasma exosomes on the proliferation CD8+ T cells(%)

圖5 CD8+ T細(xì)胞增殖能力與CR患者CD4/CD8比值的相關(guān)性Figure 5 Correlation between the proliferation of CD8+ T cells and the CD4/CD8 ratio in CR patients

本研究闡明了CR患者血漿外泌體的濃度與CD4/CD8比值的相關(guān)性，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外泌體對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響。血漿外泌體的特性，包括濃度、對(duì)正常免疫細(xì)胞功能的影響，能