劉國紅 劉琴英，2 劉波 車建美 陳倩倩

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003；2. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117）

芽胞桿菌（Bacillus）是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，好氧或兼性厭氧，能夠產(chǎn)生對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有很強(qiáng)抗性的芽胞，因此能忍受多種不良環(huán)境。芽胞桿菌是土壤微生物的重要組成部分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。有些芽胞桿菌可以在高酸、高堿、高溫、高寒等極端環(huán)境下良好生長，具有較大的生態(tài)學(xué)價值。近幾年，陸續(xù)有關(guān)不同生態(tài)條件下土壤芽胞桿菌數(shù)量和種類分布的研究文獻(xiàn)報道。劉國紅等［1］報道了新疆伊犁馬鈴薯土壤中芽胞桿菌多樣性，劉琴英等［2］調(diào)查了四川海螺溝冰川土樣中的芽胞桿菌資源，葛慈斌等［3］首次調(diào)查了武夷山各種地衣的表生和內(nèi)生芽胞桿菌種類多樣性，張華勇等［4］對紅壤地區(qū)不同生態(tài)系統(tǒng)下芽胞桿菌屬內(nèi)的物種多樣性進(jìn)行了分析，表明芽胞桿菌的多樣性指數(shù)、種類豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)隨生境的不同從林地、旱地、水田、侵蝕地呈遞減趨勢。

四川省生態(tài)資源豐富多樣，蘊藏著豐富的微生物種類。馬健華［5］從四川若爾蓋高原37份土樣中分離獲得78株芽胞桿菌，分別屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）和類芽胞桿菌屬（Paneibacillus）3個屬。胡容平等［6］調(diào)查發(fā)現(xiàn)四川甘孜州折多山與雀兒山地區(qū)土壤細(xì)菌豐富多樣，主要優(yōu)勢類群為芽胞桿菌。目前，主要是對四川森林土壤微生物多樣性研究［7-9］，專門針對芽胞桿菌種類分布的研究尚未見報道。鑒于此，本研究將對四川和重慶農(nóng)林生態(tài)區(qū)林地和農(nóng)地土壤中芽胞桿菌種類進(jìn)行調(diào)查分析，以期為芽胞桿菌資源開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)和提供菌種保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 采集深度范圍為0-15 cm或0-20 cm。各樣點采集的樣品采后裝入無菌袋內(nèi)，立即帶回實驗室供實驗分析用。樣品的具體信息，見表1。

表 1 供試土樣信息

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 PCR儀和凝膠成像分析儀（Bio-Rad公司）；恒溫培養(yǎng)箱（BI-250AG）購自施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；2×PCR Master Mix購自上海鉑尚生物技術(shù)有限公司；引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉5.0 g，pH 7.2-7.4，瓊脂15.0 g，水1.0 L。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌的分離與鑒定 土壤中芽胞桿菌的分離參考劉國紅等［10］描述的方法，將10 g土壤與90 mL無菌水振蕩20 min混勻，80℃水浴15 min，依次稀釋涂板，30℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行觀察。每份土樣重復(fù)3次。根據(jù)菌落形態(tài)特征等進(jìn)行芽胞桿菌種類歸類、統(tǒng)計計數(shù)及純化，采用-80℃甘油冷凍法進(jìn)行保存。采用Tris-飽和酚法提取芽胞桿菌基因組DNA。采用通用細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增、測序，主要參考Liu等［11］描述的方法。16S rRNA基因擴(kuò)增引物為 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。檢測出有條帶的菌株P(guān)CR產(chǎn)物送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 芽胞桿菌資源系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)所得到序列在網(wǎng)站EZtaxon-e.ezbiocloud.net上進(jìn)行序列比對分析后［12］，初步判斷得出芽胞桿菌的分類地位。選擇相關(guān)的參考菌株序列，再經(jīng)Clustal X對齊后［13］，用軟件Mega 6.0采用鄰接法和Jukes-Cantor模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［14-17］。

1.2.3 芽胞桿菌資源多樣性分析 統(tǒng)計農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌種類數(shù)、菌落數(shù)，以芽胞桿菌種類為樣本，以菌落數(shù)量為指標(biāo)，采用Ward's方法和歐式距離模型、利用統(tǒng)計軟件SPSS 20進(jìn)行聚類分析。比較分析各樣本芽胞桿菌種類的分布情況。采用物種多樣性分析常用的指數(shù)Pielou均勻度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)討論不同采樣地嗜堿芽胞桿菌物種多樣性。

式中，S為總芽胞桿菌種類數(shù)，N為芽胞桿菌個體總數(shù)，Pi是第i種的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例。

2 結(jié)果

2.1 芽胞桿菌資源的分離與鑒定

從四川和重慶農(nóng)林生態(tài)區(qū)采集的5份樣本中共分離獲得了芽胞桿菌95株，經(jīng)形態(tài)特征比較，除去冗雜菌株，選取57株菌為代表菌株進(jìn)行下一步分析。經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定，57株菌判斷為7個屬38個種，其中芽胞桿菌屬（Bacillus）22個種、賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinbacillus）4個種、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）7個種、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）2個種、嗜冷芽胞桿菌屬（Psychrobacillus）1個種、魯梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）1個種和虛構(gòu)芽胞桿菌屬（Fictibacillus）1個種。其中，芽胞桿菌屬為優(yōu)勢種群，包含41株菌，占68.3%，其次為類芽胞桿菌屬包含7株，占11.7%。根據(jù)國際細(xì)菌種的定義標(biāo)準(zhǔn)，兩菌間16S rRNA相似性低于98.65%，6株菌可能為潛在芽胞桿菌新種（表2）。

2.2 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌可分為4大類群（圖1）。第I類群為枯草芽胞桿菌類群，包含21株菌15個種。其中3株菌可能為芽胞桿菌屬的潛在新種，F(xiàn)JAT-25496與其最相近匹配模式菌株Bacillus oceanisediminisH2T的16S rRNA基因相似為97.6%，F(xiàn)JAT-25547與其最相近匹配模式菌株Bacillushorneckiae的16S rRNA基因相似為97.7%，F(xiàn)JAT-25550與其最相近匹配模式菌株Bacillus mesophilum的16S rRNA基因相似為98.1%。第II類群主要為蠟樣芽胞桿菌類群和1株Fictibacillus barbaricusFJAT-25574，其中FJAT-25509為潛在新種，與其最匹配模式菌株的16S rRNA基因相似為97.0%。第III類群為類芽胞桿菌科，包含類芽胞桿菌屬和短芽胞桿菌屬2個屬，其中類芽胞桿菌的7個種和短芽胞桿菌2個種。第IV類群主要為賴氨酸芽胞桿菌屬及1株Rummeliibacillus pycnusFJAT-25531和1株P(guān)sychrobacillus psychroduransFJAT-25571。其中，潛在新種FJAT-25531與其最相近匹配模式菌株Lysinibacillus macroides的16S rRNA基因相似為92.0%，F(xiàn)JAT-25571與其最相近匹配模式菌株P(guān)sychrobacillus psychrodurans的16S rRNA基因相似為98.6%。

2.3 農(nóng)林生態(tài)區(qū)芽胞桿菌的分布

Shannon指數(shù)多樣性分析得出，土壤芽胞桿菌Shannon指數(shù)大小依次為樂山林地＞鹽亭縣農(nóng)地＞重慶林地＞鹽亭縣林地，均勻度指數(shù)依次為鹽亭縣林地＞樂山林地＞重慶林地＞鹽亭縣農(nóng)地（表3）。

以芽胞桿菌種類為樣本，以芽胞桿菌種類含量為指標(biāo)，當(dāng)歐式距離λ=15時，可分為兩大類群（圖2）。第I類群為高含量廣分布型，包含7個種，分布在3-4個采集點，分別是韋氏芽胞桿菌、解木糖賴氨酸芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、嗜冷芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、阿氏芽胞桿菌、簡單芽胞桿菌、奇異虛構(gòu)芽胞桿菌和圖瓦永芽胞桿菌，此群主要特征為芽胞桿菌種類或含量很高，或者分布廣，其中圖瓦永芽胞桿菌和解木糖賴氨酸芽胞桿菌在所有采集點均有分離到；第II類群特征含量低分布不均勻型，僅分布在一個或2個地點，包含除第一群種類的所有芽胞桿菌種類。

2.4 林地生態(tài)區(qū)芽胞桿菌資源分布比較

林地生境類型土壤中芽胞桿菌資源種類具有不同的分布特征。鹽亭縣林地中芽胞桿菌菌落含量最高，達(dá)1.99×105CFU/g，而忠縣林地的最少，僅為3.07×103CFU/g。多樣性指數(shù)分析表明，不同地理分布林地的香農(nóng)指數(shù)相近，樂山林地的最高，而鹽亭縣林地的最低。鹽亭縣林地土壤中的優(yōu)勢種群主要為簡單芽胞桿菌，樂山林地的為短短芽胞桿菌，忠縣林地的為解木糖賴氨酸芽胞桿菌。

表2 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌的16S rRNA基因鑒定

圖1 基于16S rRNA基因的農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

表3 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中芽胞桿菌多樣性指數(shù)

圖2 農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌種類含量聚類分析

2.5 林地和農(nóng)地芽胞桿菌資源多樣性比較

不同生境類型土壤中的芽胞桿菌資源含量和種群結(jié)構(gòu)差異較大，農(nóng)地中的芽胞桿菌含量明顯高于林地，農(nóng)地的菌落含量平均為1.95×105CFU/g，林地的為0.80×105CFU/g。農(nóng)地生境類型的芽胞桿菌優(yōu)勢種群為韋氏芽胞桿菌，但在林地中未分離獲得此種群。林地的優(yōu)勢種簡單芽胞桿菌和短短芽胞桿菌亦未在農(nóng)地中獲得。

3 討論

土壤是微生物生存的大本營，不同生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境中，土壤中芽胞桿菌種類資源種群分布具有一定的差異。葛慈斌等［18］利用可培養(yǎng)方法了解了武夷山自然保護(hù)區(qū)芽胞桿菌分布狀況，芽胞桿菌屬為優(yōu)勢屬，其次為類芽胞桿菌屬和賴氨酸芽胞桿菌屬。龔國淑等［19］通過可培養(yǎng)法從成都市郊區(qū)表層土樣共分離到芽胞桿菌21個種，環(huán)狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌為優(yōu)勢種群。胡樺等［9］分析四川和重慶紫色土中硅酸鹽細(xì)菌多樣性，主要為膠胨樣芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus），還首次發(fā)現(xiàn)硅酸鹽細(xì)菌分布在蠟樣芽胞桿菌中。東寨港紅樹林土壤中含有大量的芽胞桿菌，存在較為豐富的遺傳多樣性，通過熱處理法分離獲得芽胞桿菌6個屬的種類［20］。宋敏等［21］調(diào)查了永興島土壤中芽胞桿菌資源發(fā)現(xiàn)，該生境中優(yōu)勢種群為芽胞桿菌屬和賴氨酸芽胞桿菌屬。呂剛［22］調(diào)查了河南省土壤芽胞桿菌多樣性，獲得了芽胞桿菌5個屬即芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬、鳥氨酸芽胞桿菌屬（Ornithinibacillus）、短芽胞桿菌屬和類芽胞桿菌屬。優(yōu)勢種是巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）和簡單芽胞桿菌（Bacillus simplex）。上述研究結(jié)果表明，土壤中含有豐富的芽胞桿菌資源，芽胞桿菌屬為主要優(yōu)勢種，不同生境類型下芽胞桿菌的種群組成具有一定的差異。

本研究從四川和重慶采集的土壤樣本中共分離獲得芽胞桿菌7個屬的38個種，芽胞桿菌屬為所有生境中的優(yōu)勢屬，優(yōu)勢種為圖瓦永芽胞桿菌、簡單芽胞桿菌、短短芽胞桿菌和解木糖賴氨酸芽胞桿菌，這與上述研究中優(yōu)勢種群不一致。本研究中的芽胞桿菌屬和賴氨酸芽胞桿菌屬為不同生境的共有屬，這與永興島土壤的研究結(jié)果基本一致；而短芽胞桿菌屬、嗜冷芽胞桿菌屬、魯梅爾芽胞桿菌屬和虛構(gòu)芽胞桿菌屬4個屬僅在1個樣本出現(xiàn)，為本研究的特有屬。本研究未獲得河南省土壤中發(fā)現(xiàn)的Ornithinibacillus，而嗜冷芽胞桿菌屬、魯梅爾芽胞桿菌屬和虛構(gòu)芽胞桿菌屬亦未在河南省土壤中發(fā)現(xiàn)，這可能與土壤類型和地理位置有一定關(guān)系。本研究結(jié)果表明農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤樣本中芽胞桿菌的菌落數(shù)量為3.07×103-1.99×105CFU/g干土，與龔國淑等［19］調(diào)查的成都郊區(qū)土壤中的芽胞桿菌數(shù)量（4.30×103-8.53×105CFU/g干土）具有一致性。

根據(jù)國際細(xì)菌種的定義標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)未知菌株與其最相近模式菌株間的16S相似性低于98.65%時，未知菌株可能為新種［23］。本研究從四川和重慶農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中發(fā)現(xiàn)6株芽胞桿菌與其相近菌的16S相似性低于種的界限閾值，為芽胞桿菌潛在新種。其中1株已在IJSEM正式發(fā)表［11］，另外5株需要多相分類指標(biāo)進(jìn)一步驗證確定其準(zhǔn)確的分類地位。

芽胞桿菌多樣性指數(shù)分析表明，樂山林地芽胞桿菌的Shannon指數(shù)最高，而鹽亭縣林地的最低。同種芽胞桿菌在不同的環(huán)境條件下分布不同，如解木糖賴氨酸芽胞桿菌在所有樣本均存在，短短芽胞桿菌僅在樂山林地土壤中獲得且為其優(yōu)勢種。駱婷等［24］調(diào)查發(fā)現(xiàn)森林土壤中較高的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，并篩選獲得了具有多功能降解作用的類芽胞桿菌。不同區(qū)域間的物種存在著差異性，其優(yōu)勢種也具有一定的差異，如鹽亭縣農(nóng)地生境類型的優(yōu)勢芽胞桿菌種群為韋氏芽胞桿菌，鹽亭縣林地的優(yōu)勢種群為簡單芽胞桿菌。本研究表明農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤中蘊藏著豐富的芽胞桿菌資源，且含有一定的新資源，為芽胞桿菌新資源挖掘和功能菌株開發(fā)提供了保障。

4 結(jié)語

從四川省和重慶市農(nóng)林生態(tài)區(qū)采集的5份土壤樣品中分離獲得芽胞桿菌95株，去重復(fù)后選取57株，通過細(xì)菌通用引物16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序、比對，鑒定57株菌為芽胞桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinbacillus）、類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）、短芽胞桿菌屬（Brevibacillus）、嗜冷芽胞桿菌屬（Psychrobacillus）、魯梅爾芽胞桿菌屬（Rummeliibacillus）和虛構(gòu)芽胞桿菌屬（Fictibacillus），其中優(yōu)勢屬為芽胞桿菌屬。根據(jù)細(xì)菌種的界定閾值16S rRNA小于98.65%，發(fā)現(xiàn)6株分離菌為潛在芽胞桿菌新種。芽胞桿菌種類可分為高含量分布廣型和低含量分布不均勻型，農(nóng)林生態(tài)區(qū)土壤芽胞桿菌多樣性指數(shù)依次為樂山林地＞ 鹽亭縣農(nóng)地＞ 重慶。