謝麗基，謝芝勛，羅思思，鄧顯文，謝志勤，王 盛，黃嬌玲 ，曾婷婷，張艷芳，范 晴，張民秀

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001)

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的以感染禽類(lèi)為主的一種急性、烈性傳染病。NDV 基因組包含 6 個(gè)基因，分別編碼 3′N(xiāo)P-P-M-F-HN-L5′六種結(jié)構(gòu)蛋白。HN糖蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，在病毒侵染過(guò)程中識(shí)別細(xì)胞受體，介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞膜，是極其重要的保護(hù)性抗原[1]，對(duì) NDV的毒力有很大的影響?？贵w免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因[2]。

野鳥(niǎo)作為新城疫病毒的自然儲(chǔ)存宿主，可能成為病毒的傳播媒介，隨自然遷徙可將病毒傳染給家禽，導(dǎo)致疾病暴發(fā)[3]。新疆、吉林、湖南和陜西等地均報(bào)道了對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)新城疫進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，探索了野生鳥(niǎo)類(lèi)與家禽新城疫感染的區(qū)別和聯(lián)系，通過(guò)分析新城疫病毒的遺傳進(jìn)化情況，可預(yù)測(cè)新城疫病毒感染家禽的流行趨勢(shì)，可為新城疫的防治提供理論依據(jù)[3-4]。

本試驗(yàn)對(duì)2016-2017年度從廣西野鳥(niǎo)分離到的10株NDV的HN基因，采用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，并對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為科學(xué)防控新城疫提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株 10株廣西野鳥(niǎo)源NDV分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存，其中鷓鴣源2株，斑鳩源5株，鴿子源3株。

1.2 主要試劑 病毒基因組RNA/DNA快速純化試劑盒和DNA片段膠回收試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit、Premix Ex TaqTM試劑盒和pMD18-T試劑盒,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3HN基因PCR擴(kuò)增的引物 NDVHN基因擴(kuò)增上游引物HN2265-F:5′-CCTMGATCAGATGAGAGC-3′，下游擴(kuò)增引物HN2265-R:5′-TGTGACTCTGGTAGGAT-3′[5]，擴(kuò)增的片段大小為2 265 bp。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取、RT-PCR 取200 μL NDV分離株的病毒尿囊液，按照北京全式金生物技術(shù)有限公司的病毒基因組RNA/DNA快速純化試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，提取病毒 RNA，然后按照寶生物工程(大連)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用引物HN2265-F和HN2265-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 PCR 產(chǎn)物膠回收、克隆測(cè)序 將50 μL PCR產(chǎn)物電泳后，切膠經(jīng)DNA片段膠回收試劑盒純化回收。將純化PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體。陽(yáng)性克隆送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6HN基因進(jìn)化樹(shù)與同源性比較 應(yīng)用Lasergen和MEGA 6軟件，對(duì)測(cè)序獲得的 10株NDV分離株HN基因序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的NDV代表株進(jìn)行序列對(duì)比分析，采用鄰位相連法(Neighbor-joining)和 Bootstrap值為1 000構(gòu)建NDV分離株HN基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 廣西野鳥(niǎo)源NDV分離株HN基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 運(yùn)用RT-PCR對(duì)10 株野鳥(niǎo)源NDV分離株進(jìn)行HN基因的擴(kuò)增，均擴(kuò)增出約2 265 bp的電泳條帶(圖1)。序列測(cè)定結(jié)果表明，10 株野鳥(niǎo)源NDV分離株HN基因的ORF全長(zhǎng)均為1 716 bp，編碼571個(gè)氨基酸。

圖1 NDV 廣西分離株HN基因擴(kuò)增結(jié)果

M: 100 bp DNA ladder ; 1: 鷓鴣源新城疫 ； 2: 鷓鴣源新城疫；3: 鴿子源新城疫 ； 4: 鴿子源新城疫； 5: 鴿子源新城疫 ； 6: 斑鳩源新城疫； 7: 斑鳩源新城疫 ； 8: 斑鳩源新城疫 ； 9: 斑鳩源新城疫 ； 10: 斑鳩源新城疫

2.2 廣西野鳥(niǎo)源NDV分離株HN基因序列的遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用Lasergen軟件，將測(cè)序獲得的 10株NDV分離株HN基因的閱讀框架序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的NDV代表株序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，10株NDV廣西野鳥(niǎo)源分離株HN基因之間的核苷酸同源性為83.9%～99.9%(其中159 Francolinus pintadeanus19與173 Turtledove7同源性最低，為83.7%)，所推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為87.4%～99.7%(其中159 Francolinus pintadeanus19與173 Turtledove7 的同源性最低，為87.4%)。與國(guó)內(nèi)外 NDV class Ⅱ參考毒株的核苷酸同源性為80.2%～98.1%， 其中2株從鷓鴣分離的NDV病毒，與 NDV基因XII型的同源性較高，為98.0%～98.1%；而斑鳩源的5株NDV病毒，以及從鴿子源的3株NDV病毒，與NDV基因VI型的同源性較高，為90.0%～91.9%。構(gòu)建的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2。所分離的10個(gè)NDV毒株，8株為Ⅱ類(lèi)新城疫病毒基因VI型(斑鳩源5株，鴿子源3株)，鷓鴣分離的2株新城疫病毒，均為Ⅱ類(lèi)新城疫病毒基因XII型。10株廣西野鳥(niǎo)NDV分離株與我國(guó)經(jīng)典強(qiáng)毒株F48E9、弱毒疫苗株LaSota和基因VII型NDV(我國(guó)目前應(yīng)用最廣的疫苗株基因型之一)遺傳距離較遠(yuǎn)(見(jiàn)圖2) 。

3 討論

NDV的HN基因開(kāi)放閱讀框(ORF)有4種長(zhǎng)度：第1種，ORF全長(zhǎng)為1 851 bp，編碼 616個(gè)氨基酸，該蛋白只存在于無(wú)致病性的 NDV 弱毒株中；第2種，ORF全長(zhǎng)為1 734 bp，編碼 577個(gè)氨基酸，存在于無(wú)致病性和致病性的 NDV 毒株中；第3種ORF 全長(zhǎng)為1 716 bp，編碼 571 個(gè)氨基酸，僅存在于致病性的 NDV 強(qiáng)毒株中；第4種ORF全長(zhǎng)為1 716 bp，編碼 571 個(gè)氨基酸，未確定存在于何種致病性的 NDV 毒株中[6]。本試驗(yàn)測(cè)定的10 株廣西野鳥(niǎo)源 NDV分離毒株的HN基因ORF 均為 1 716 bp，編碼 571個(gè)氨基酸，符合 NDV 強(qiáng)毒株的基因長(zhǎng)度特征，與用 NDVF基因裂解位點(diǎn)來(lái)判斷其為強(qiáng)弱毒株的結(jié)果一致[7]。

圖2 10株廣西野鳥(niǎo)源NDV分離株與國(guó)內(nèi)外NDV參考株HN基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

據(jù)報(bào)道，我國(guó)新疆、吉林、湖南和陜西等地野鳥(niǎo)分離的新城疫病毒，主要為Ⅱ類(lèi)新城疫病毒基因I型、基因II型 和基因VI型[4]。與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的報(bào)道類(lèi)似，本試驗(yàn)在廣西野鳥(niǎo)中也發(fā)現(xiàn)了Ⅱ類(lèi)新城疫病毒基因VI型。近年來(lái)，在我國(guó)家禽首次監(jiān)測(cè)到了Ⅱ類(lèi)新城疫病毒基因XII型[8]，除了本團(tuán)隊(duì)在2018年最新的研究報(bào)告[7]，未見(jiàn)在野鳥(niǎo)發(fā)現(xiàn)Ⅱ類(lèi)新城疫病毒基因XII型的研究報(bào)道。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)我國(guó)鳥(niǎo)類(lèi)感染了Ⅱ類(lèi)新城疫病毒基因XII型，提示應(yīng)警惕這種新型新城疫病毒在國(guó)內(nèi)野鳥(niǎo)和家禽的分布和流行，加大主動(dòng)監(jiān)測(cè)力度，分析其流行和擴(kuò)散趨勢(shì)。由于當(dāng)前所使用的新城疫疫苗主要為基因VII型、基因II型和基因I型，鑒于我國(guó)基因XII型新城疫的新發(fā)現(xiàn)，有必要開(kāi)展當(dāng)前疫苗對(duì)XII型新基因型新城疫的免疫效果評(píng)估。

本試驗(yàn)分離的10株新城疫病毒，分離時(shí)野鳥(niǎo)狀態(tài)均良好，無(wú)發(fā)病跡象，推測(cè)野鳥(niǎo)對(duì)基因VI型和XII型新城疫具有較好的適應(yīng)能力與抵抗性，存在對(duì)周邊環(huán)境排毒的危險(xiǎn)，廣西地區(qū)鳥(niǎo)類(lèi)資源豐富，為新城疫病毒的傳播創(chuàng)造了便利條件。