鐘建平，李 睿，王國松，洪俊平，付 饒，陳毅歆,

根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的《2017中國癌癥報告》顯示：與2012年相比，我國2013年癌癥新發(fā)人數(shù)繼續(xù)上升，累計病例數(shù)從385萬增加到398萬，增幅3%，占當年世界新發(fā)病例的近25%。其中，結腸癌增長趨勢明顯，在男性腫瘤中其發(fā)病率排第5位，在女性腫瘤中排第3位，綜合死亡率排第5位，位于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌之后。目前在臨床上結腸癌以手術切除治療為主，放療化療以及免疫治療為輔[1]。手術治療之后，結腸癌比較容易轉移和復發(fā)，是結腸癌引起患者死亡的主要原因[2]。

免疫治療是最有前景的腫瘤治療手段之一，曾入選《科學》雜志“2013 十大科學突破”榜首[3]。基于病毒的溶瘤治療是免疫治療的重要途徑之一，包括人類單純皰疹病毒(HSV)、新城疫病毒(NDV)、腺病毒(Adenovirus)、柯薩奇病毒(Coxsackie virus)、麻疹病毒(measles virus，MV)、呼吸道腸道病毒(reovirus)、水皰性口炎病毒(VSV)等在內的病毒都已被證明具有溶瘤作用[4-5]，可通過直接感染裂解腫瘤細胞、激活機體免疫系統(tǒng)等多種途徑發(fā)揮腫瘤的抑制或清除作用，部分病毒株已在臨床治療中顯示出良好的治療效果，其中1株改造過的HSV溶瘤病毒已經在美國正式上市[6-8]。

NDV是一種單鏈負義RNA病毒，屬于副粘病毒科，主要感染禽類，偶見患者感染事件，引起結膜炎[9]和溫和的流感癥狀等[10]。從20世紀60年代至今，已有73-T、MTH-68、PV701、HUJ、La Sota等多個NDV減毒株或弱毒株開展了一期和二期藥物臨床試驗[6, 11-13]，但都沒有進入三期臨床試驗階段，提示現(xiàn)有的NDV弱毒株或減毒株的治療效果可能不夠好，因此，有必要開發(fā)療效更好的NDV溶瘤病毒株。胡立華[14]等比較了NDV強毒株F48E9和NDV弱毒株LaSota對大腸癌細胞LS1747的體外殺傷效果，提示F48E9可能具備溶瘤治療潛能，但該研究未在動物水平上評估F48E9溶瘤抑制效果和治療安全性。因此，本研究擬以CT26小鼠結腸癌為模型，深入研究NDV強毒株F48E9對CT26腫瘤細胞和CT26小鼠皮下移植瘤的體內外抑制作用，并通過靜脈注射小鼠評價F48E9的體內治療安全性，從而確定NDV強毒株F48E9是否可作為候選病毒株進行后續(xù)的反向遺傳學改造，為最終建立高效安全的NDV溶瘤病毒株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1病毒、細胞及實驗動物 新城疫病毒株F48E9為中國農業(yè)大學王曉佳教授饋贈；結腸癌CT26細胞購自ATCC(#ATCC CRL-2638)；BALB/c小鼠(6-8周齡)購自上海斯萊克實驗動物有限公司(#003)。

1.2實驗試劑與耗材 細胞活力檢測CCK-8試劑盒購自碧云天公司(#C0040)；細胞增殖多克隆抗體Ki-67購自NOVUS公司(# NB110-89717)；即用型免疫組化試劑盒UltraSenitive TM SP購自福州邁新公司(#KIT9720)，內含內源性氧化物阻斷試劑、正常動物免疫血清(羊)、生物素標記的第二抗體及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶；DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司(#DAB-0031)；蘇木精染色液購自SIGMA-ALDRICH公司(# HHS16)；醇溶伊紅染色液購自SIGMA-ALDRICH公司(#HT110116)。

1.3 方 法

1.3.1F48E9的培養(yǎng)、滴定 培養(yǎng)Vero細胞，當細胞處于對數(shù)生長期并且狀態(tài)良好時，消化細胞，使用細胞計數(shù)儀計數(shù)，并將3×106個Vero細胞鋪在10 cm細胞培養(yǎng)板中，放置在37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h等到細胞完全覆蓋細胞板時取其中一板進行消化計數(shù)并記錄。使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋F48E9病毒液，再按照MOI=0.1(病毒數(shù)/細胞數(shù)，MOI)感染Vero細胞，放置在溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每15 min搖晃1次，孵育75 min使病毒充分吸附在細胞上，之后棄去殘余的病毒液并加入10 mL 含2%血清的維持液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后收取細胞，反復凍融裂解細胞3次，然后使用3 000 r/min離心細胞裂解物15 min，除去細胞碎片，分裝上清液至病毒凍存管中并進行空斑形成實驗滴定病毒的滴度，空斑實驗方法參見文獻[15]，保存在-80 ℃超低溫冰箱中。

對生產的病毒進行免疫熒光實驗，進一步證明F48E9感染細胞的活性。消化Vero細胞，然后鋪板至24孔板中，每孔2×105個細胞。細胞貼壁生長，覆蓋80%～90%培養(yǎng)孔時，進行免疫熒光實驗。一抗為本實驗制備的F48E9株NP蛋白小鼠單克隆抗體4E7，二抗為TRITC標記的羊抗鼠熒光二抗，DAPI染細胞核[16]。使用熒光顯微鏡進行拍照并分析。

1.3.2F48E9對CT26細胞的體外感染抑制實驗 胰酶消化CT26細胞，按每孔0.1 mL濃度為2×105個細胞鋪至96孔板中；稀釋F48E9病毒，分別按MOI=10、1、0.1、0.01感染鋪板12h后的CT26細胞，每個病毒濃度梯度設置3孔重復；在感染72 h后用CCK-8試劑盒檢測細胞活力的變化，實驗操作方法參照試劑盒說明書。

1.3.3F48E9對CT26細胞小鼠皮下移植腫瘤的體內抑制實驗 培養(yǎng)CT26細胞，消化制備成濃度為5×107個/ mL的細胞懸液，接種于16只6周齡BALB/c雌鼠右側背部皮下，每只小鼠接種0.1 mL細胞，接種數(shù)量是5×106個細胞；接種后持續(xù)監(jiān)測皮下腫瘤的生長狀態(tài)并測量腫瘤的大小，在接種約十天后挑選10只腫瘤大小均一且體積達到80～100 mm3的小鼠進行溶瘤治療，隨機分成兩組，每組5只；治療實驗組小鼠經瘤內注射0.1 mL濃度為2×107pfu的F48E9，未治療對照組小鼠經瘤內注射0.1 mL PBS緩沖液，每隔一天注射1針，共注射5針。每天使用數(shù)字游標卡尺測量腫瘤的尺徑和觀察小鼠的生存情況，腫瘤體積計算公式為 V=ab2/2 (a為長徑，b為短徑)，當小鼠皮下腫瘤任一邊長的直徑大于18 mm時出于動物倫理考慮判定為死亡，并實施安樂死[17]。

1.3.4F48E9溶瘤治療CT26皮下瘤的免疫組化分析 按照上述方法構建CT26細胞皮下移植瘤，選取8只腫瘤體積為80～100 mm3的小鼠隨機分成兩組，每組4只；實驗組為瘤內注射0.1 mL濃度為 2×107pfu的F48E9毒株，對照組為瘤內注射0.1 mL PBS緩沖液，每2 d注射1針病毒液，共注射3針；第3針注射2 d后對全部8只小鼠實施安樂死，取出腫瘤組織進行組織化學染色[18]。組織脫蠟復水后，山羊血清封閉1 h；一抗為商品化的兔多抗Ki-67抗體和PBS對照，4度孵育過夜，PBS洗3次；生物素標記的羊抗兔二抗常溫孵育10 min，PBS洗3次；過氧化物酶標記的鏈霉素抗生物素蛋白三抗常溫孵育10 min，PBS洗3次；DAB顯色液顯色30 s，去離子水終止顯色反應。使用奧林巴斯正置熒光顯微鏡(BX51)和cellSens Standard軟件進行拍照并分析組織化學染色結果。

1.3.5F48E9的小鼠體內安全性分析 取20只6周齡BALB/c雌鼠隨機分成2組，每組10只，稱量其體重；隨后進行小鼠尾靜脈攻毒，實驗組的每只小鼠經尾靜脈注射1 mL 濃度為2×107pfu的F48E9病毒，對照組為1 mL PBS緩沖液，每2 d進行1次尾靜脈注射，共3針；第3針注射2 d后從實驗組和對照組中各取4只小鼠實施安樂死，取出主要器官進行蘇木素-伊紅染色，其余小鼠每4 d稱量1次體重并觀察小鼠的活動狀態(tài)。取浸泡后的小鼠主要器官進行包埋脫蠟復水，蘇木素染色液染色，脾臟1 min，腎臟2 min，肝臟8 min，肺組織10 min。染色結束后，去離子水清洗三遍。鹽酸酒精分化4 s，迅速用去離子水終止分化，去離子水清洗三遍，去離子水返藍45 min。伊紅染色1 min，去離子水終止染色。使用奧林巴斯正置熒光顯微鏡(BX51)和cellSens Standard軟件進行拍照并分析組織化學染色結果。

1.3.6統(tǒng)計與分析 對于兩組數(shù)據(jù)之間的比較，采用t檢驗進行統(tǒng)計分析；對于兩組以上的數(shù)據(jù)采用方差分析進行顯著性評估。當P<0.05時，表示結果具有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1F48E9株的培養(yǎng)和滴定 用Vero細胞株培養(yǎng)擴增F48E9，收獲的病毒液分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱中，經空斑形成試驗法滴定，滴度為2×107pfu/mL。F48E9感染Vero細胞后可以形成肉眼可見的明顯病毒空斑(圖1A)，免疫熒光試驗顯示用F48E9的NP特異性單抗能在感染F48E9的細胞中檢測到熒光信號(圖1B)，表明病毒株F48E9在Vero細胞中得到特異性擴增。

2.2F48E9對CT26結腸癌細胞的生長抑制作用 F48E9株感染CT26細胞72 h后，使用CCK-8法測定細胞活力水平。結果顯示，當MOI=10、1、0.1、0.01時，CT26細胞的活力分別為44.6%、53.8%、84.9%、96.2%，說明新城疫病毒F48E9株能夠有效抑制CT26細胞的生長，其抑制效果與病毒的感染劑量成正相關，即感染病毒的MOI越高，對CT26細胞活力的抑制越明顯(圖2)。

2.3F48E9對CT26細胞小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用 在免疫功能正常的BALB/c小鼠皮下接種CT26細胞，等腫瘤生長至體積為80～100 mm3時，實驗組小鼠經瘤內注射F48E9病毒液，對照組小鼠注射PBS緩沖液，持續(xù)監(jiān)測腫瘤的生長和小鼠生存情況。結果顯示，實驗組小鼠的皮下腫瘤始終處于抑制狀態(tài)，其腫瘤體積遠遠小于PBS對照組(圖3A，B)；同時，病毒實驗組小鼠的中位生存期為38 d，平均總生存期為38.4 d，PBS對照組的中位生存期為14 d，平均總生存期為15.2 d。上述結果表明，新城疫病毒F48E9能顯著抑制CT26結腸癌細胞小鼠皮下移植瘤的生長，顯著延長小鼠生存期(圖3C)。

圖1 新城疫病毒株F48E9的培養(yǎng)和滴定空斑實驗(A)和免疫熒光實驗(B)Fig.1 Culture and titration of Newcastle disease virus F48E9 strain Plaque assay (A) and immunofluorescence assay (B)

(****P<0.000 1，*P<0.05，no.P>0.05)圖2 新城疫病毒株F48E9對CT26結腸癌細胞的生長抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of Newcastle disease virus F48E9 strain on the growth of CT26 cells

2.4F48E9可抑制CT26荷瘤小鼠內腫瘤細胞的增殖 為進一步確定F48E9是否通過抑制腫瘤細胞的增殖來抑制小鼠皮下移植瘤的生長，取CT26荷瘤BALB/c小鼠進行瘤內注射實驗。實驗組瘤內注射3針F48E9病毒液，然后對小鼠實施安樂死，取出腫瘤組織進行免疫組織化學分析，觀察細胞增殖標記物Ki-67蛋白的表達情況，對照組注射PBS緩沖液。Ki-67蛋白是一種核定位蛋白，只表達于細胞分裂期，Ki-67的過表達與細胞快速增殖密切相關。免疫組化分析結果顯示，注射F48E9的小鼠皮下腫瘤細胞呈Ki-67陽性的細胞數(shù)明顯少于注射PBS的對照組小鼠(圖4)，提示新城疫病毒株F48E9可能通過抑制小鼠腫瘤細胞的增殖來抑制小鼠皮下腫瘤的生長。

2.5新城疫病毒F48E9的安全性評估 為評估新城疫病毒F48E9的治療安全性，取F48E9對健康BALB/c小鼠進行尾靜脈注射(n=10)。注射3針病毒后，實驗組和對照組各取4只小鼠進行安樂死處理，然后取主要臟器進行蘇木素-伊紅染色，觀察注射F48E9病毒是否會引起小鼠器官損傷，對其余每組各6只小鼠持續(xù)監(jiān)測其體重并觀察動物活動狀態(tài)。結果顯示，接種F48E9病毒的小鼠活動正常，其飲食、毛色等沒有出現(xiàn)異常情況；體重監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，病毒接種組與PBS接種組的小鼠體重未見明顯差別，都沒有明顯的下降或波動(圖5.A)，存活率都是100%(圖5.B)；蘇木素-伊紅染色表明，病毒接種組和PBS接種組的染色細胞未見明顯差異，組織細胞都呈正常形態(tài)(圖5.C)。上述結果表明新城疫病毒強毒株F48E9對BALB/c小鼠具有良好的安全性。

3 討 論

本文研究新城疫病毒強毒株F48E9對小鼠結腸癌CT26腫瘤細胞的體內外生長抑制作用并評價其在小鼠體內的安全性。結果顯示強毒株F48E9在體外能顯著抑制CT26細胞的生長，在小鼠體內能通過抑制腫瘤細胞的增殖來抑制腫瘤的生長；而且F48E9對BALB/c小鼠的治療具有良好的安全性，尾靜脈注射病毒未對小鼠造成明顯的副作用。

新城疫病毒株F48E9作為國內標準強毒株，國內對F48E9的研究主要集中于禽類疫苗以及F48E9 的生物學特性等，罕見其用于溶瘤治療的研究報道。胡立華[14]等比較了強毒株F48E9和弱毒株LaSota對大腸癌細胞LS1747的體外殺傷效果，但是沒有進行體內評價實驗，本研究將F48E9應用于CT26細胞BALB/c小鼠移植瘤模型的治療研究，對F48E9的腫瘤治療潛能有更全面的認識。國外也有利用NDV治療CT26小鼠抑制瘤的研究報道，García-Sastre[17]等把由弱毒株NDV-B1株改造F蛋白裂解位點而得到的rNDV-F3aa用于接種在BALB/c小鼠CT26腫瘤的治療，小鼠中位生存期由PBS對照組的13 d延長到實驗組的23 d。本研究使用的F48E9溶瘤株可以將小鼠中位生存期由14 d延長至38 d，顯示出更好的溶瘤治療效果。為進一步全面認識新城疫病毒株F48E9的溶瘤治療潛能，還需進行更多的后續(xù)研究，如應用更多種類的腫瘤細胞系進行體內外治療潛能評價，應用人源結腸癌裸鼠模型進行腫瘤治療評價，評估F48E9與PD-1、CTLA-4與CD47等腫瘤抗體聯(lián)用的治療效果[19-20]。

小鼠腫瘤體積的增長值(A)及其平均值(B)，荷瘤小鼠生存率，P<0.01(C)，治療17 d后的腫瘤大小圖像(D)。PBS組為對照組。圖3 新城疫病毒株F48E9對CT26結腸癌細胞的小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of Newcastle disease virus strain F48E9 on the transplanted tumors in BALB/c mice

PBS對照組Ki-67蛋白呈陽性的細胞數(shù)明顯高于F48E9治療組。標尺=20 μm。圖4 新城疫病毒株F48E9抑制CT26腫瘤細胞的增殖Fig.4 F48E9 strain can inhibit the proliferation of CT26 tumor cells from transplanted mice

病毒處理組和PBS對照組的小鼠體重沒有明顯的差異，都沒有下降或者波動的現(xiàn)象(A)，實驗組和對照組的小鼠存活率均為100%(B)，蘇木素-伊紅染色表明實驗組和對照組小鼠的主要器官都沒有損傷(C)。標尺=50 μm。圖5 新城疫病毒株F48E9的治療安全性評價Fig.5 Safety evaluation of Newcastle disease virus strain F48E9 in BALB/c mice

在溶瘤治療研究中，給藥治療起始節(jié)點的早與晚對腫瘤治療效果影響十分明顯。本研究中選取的是接種約10 d，腫瘤體積較大(80～100 mm3)的小鼠進行治療，而其他NDV溶瘤研究中選取的腫瘤體積較小，多為50 mm3以內[17,19]。盡管如此，本研究中F48E9對大腫瘤依然表現(xiàn)出很好治療作用，說明NDV強毒株F48E9具有高效的溶瘤治療作用，對中晚期大腫瘤也具備較好的治療潛能。另外，由于小鼠個體的差異，對同一批次的小鼠接種相同數(shù)目的腫瘤細胞，腫瘤的生長速度不盡相同[21]。本研究采取的策略是挑選腫瘤形狀規(guī)則大小均一的荷瘤小鼠，再隨機分組，有效地避免了腫瘤治療點腫瘤大小差異而帶來的實驗偏差。

關于NDV的溶瘤治療機制研究，我們以細胞周期蛋白Ki-67作為細胞增殖標記物[22]，通過組織化學染色分析了F48E9病毒處理組腫瘤組織中Ki-67蛋白的表達情況，證明Ki-67蛋白陽性細胞數(shù)明顯少于PBS對照組，提示F48E9抑制細胞增殖可能是其發(fā)揮抗腫瘤的機制之一。有研究還報道了其他新城疫病毒株的溶瘤治療機制，如Adam Vigil[23]等通過比較新城疫溶瘤毒株對接種于裸鼠和BALB/c小鼠CT26腫瘤的治療效果，證明新城疫毒株對CT26腫瘤的治療依賴于T淋巴細胞，又如Hong Sui[24]等使用新城疫毒株NDV-D90治療接種于裸鼠的人源胃癌細胞，證明NDV-D90可能通過下調VGEF-A和MMP-2來抑制腫瘤血管的生成，進而抑制腫瘤的生長。因此，后續(xù)工作還需進一步系統(tǒng)地研究F48E9的溶瘤治療機制。

新城疫病毒弱毒株作為一種安全的溶瘤制劑或者腫瘤疫苗載體，已得到廣泛的認可，而對于新城疫病毒強度株是否適合應用于腫瘤治療依然存在爭議，考慮的主要是強毒株的安全性。本研究通過小鼠尾靜脈攻毒實驗，證明NDV強毒株F48E9對BALB/c小鼠沒有明顯的毒副作用，其體內治療具有良好的安全性。盡管新城疫強毒株在實驗小鼠體內表現(xiàn)出了良好的安全性，但是依然存在潛在的擴散風險，需要在后續(xù)的研究中構建F48E9株的反向遺傳系統(tǒng)進行改造，保留其良好的溶瘤特性的同時降低潛在的風險。

總之，研究初步顯示新城疫病毒強毒株F48E9對結腸癌CT26腫瘤具有較好的治療作用且安全性良好，展示出較好的溶瘤治療潛能，為充分認識新城疫病毒強毒株的溶瘤治療性能提供有用的實驗數(shù)據(jù)，為后續(xù)的反向遺傳改造奠定實驗基礎。

利益沖突：無

本文引用格式：鐘建平, 李睿, 王國松, 等. 新城疫病毒株F48E9對CT26小鼠結腸癌的溶瘤治療作用[J]. 中國人獸共患病學報, 2019,35(4):292-298,319. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.026