王 卓,王建偉2,于 淼,馮 立,王秀紅,許志偉, 田 圃2，吳益民

新埃立克體(CandidatusNeoehrlichiamikurensis，Nm)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種蜱媒病原體，隸屬立克次體目無(wú)形體科新埃立克體屬(CandidatusNeoehrlichia)[1-2]。Nm最早于1999年在荷蘭的篦子硬蜱(Ixodesricinus)中檢測(cè)到, 被認(rèn)為是一種類似埃立克體(Ehrlichia-like)的病原體[3]。2004年，日本學(xué)者Kawahara等通過(guò)基于16S rRNA基因和groEL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析將該病原體歸為無(wú)形體科的一個(gè)新種，命名為CandidatusNeoehrlichiamikurensis[2]。近年來(lái)，歐洲多個(gè)國(guó)家和地區(qū)以及俄羅斯(遠(yuǎn)東、西伯利亞地區(qū))、日本等地的蜱或嚙齒動(dòng)物中均有關(guān)于Nm發(fā)現(xiàn)的報(bào)道, 表明該病原體呈世界性分布[1-6]。流行病學(xué)調(diào)查研究證實(shí)我國(guó)一些省份小嚙齒動(dòng)物存在Nm感染, 并從蜱咬發(fā)熱患者中發(fā)現(xiàn)Nm感染病例[7-8]。

東北地區(qū)是我國(guó)重要的蟲媒傳染病自然疫源地，特別是蜱媒傳染病，媒介蜱和動(dòng)物宿主攜帶病原體種類豐富，如黑龍江立克次體、查菲埃立克體、森腦病毒和伯氏疏螺旋體等[9-11]。為了解Nm自然感染狀況和特點(diǎn), 本研究在東北地區(qū)的密山、集安和寬甸采集嚙齒動(dòng)物標(biāo)本，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行Nm感染的病原分子生物學(xué)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1鼠標(biāo)本來(lái)源 選擇黑龍江省密山縣(2016年)低山丘陵耕地，吉林省集安市、遼寧省寬甸縣(2012年)針闊混交林區(qū)和林緣耕地，采用夾夜法和籠夜法捕獲嚙齒動(dòng)物。所有嚙齒動(dòng)物現(xiàn)場(chǎng)分類鑒定, 經(jīng)消毒處理后解剖取其脾臟，置于1.5ml細(xì)胞冷凍管內(nèi)，液氮保存。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置-80 ℃保存。鼠標(biāo)本采集地點(diǎn)見(jiàn)圖1。

圖1 本研究采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Geographic location of collected rodents

1.2鼠脾標(biāo)本DNA提取 剪取約3 mm3脾組織，置于玻璃研磨器中充分研碎，應(yīng)用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN) 按說(shuō)明書操作提取DNA，DNA提取液置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴(kuò)增 用巢式PCR擴(kuò)增NmgroEL基因(熱休克蛋白基因)，groEL基因引物按文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)，由上海申工生物工程公司合成。Nm的一輪PCR采用外引物Nm-out1 (5′-TGGCAAATGTAGTTGTAACAGG-3′)/Nm-out2(5′-TCTACTTCACTTGAACCGCCA-3′)。擴(kuò)增條件: 94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 40個(gè)循環(huán)后，72 ℃再延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段大小為1 147 bp;二輪PCR采用內(nèi)引物Nm-in1(5′-CCTATTAGTAAGCCTTATGGTAC-3′)/Nm-in2(5′-GAAGAATTACTATCTACGCTACC-3′)。二輪擴(kuò)增條件除72 ℃延伸60 s, 35個(gè)循環(huán)不同, 其它與一擴(kuò)相同。最終擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段大小為891 bp。

1.4序列測(cè)定及分子遺傳進(jìn)化分析 PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物由上海申工生物技術(shù)公司測(cè)序。應(yīng)用Internet網(wǎng)中BLAST操作平臺(tái)，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中注冊(cè)的NmgroEL基因序列進(jìn)行比較，采用DNAstar及Mega5.0軟件進(jìn)行同源性分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1嚙齒動(dòng)物種類與分布 在東北地區(qū)3個(gè)調(diào)查點(diǎn)捕獲嚙齒動(dòng)物共181只，包括6個(gè)鼠種，鼠種與分布見(jiàn)表1。黑線姬鼠(Apodemusagrarius)所占比例最高，占70.17%;其次為林姬鼠(Apodemuspeninsulae)、大倉(cāng)鼠(Tscherskiatriton)和褐家鼠(Rattusnorvegicus), 分別占13.26%、8.29% 和7.18%。小林姬鼠(Apodemussylvaticua)和鼩鼱(Sorexaruneus)較少，分別占0.55%。

2.2嚙齒動(dòng)物中Nm感染情況 應(yīng)用groEL基因的巢式PCR檢測(cè)3地181只野鼠，5只感染Nm, 感染率為2.76%(表1)。其中, 集安(JA)和寬甸(KD)野鼠感染率分別為5.97%(4/67)和1.52%(1/66),密山野鼠未檢出陽(yáng)性, 3地野鼠Nm感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.3124,P=0.1158)。感染鼠種主要涉及黑線姬鼠(2.36%)和林姬鼠(8.33%), 其它鼠種未檢出陽(yáng)性。

2.3基因序列比較 經(jīng)序列比對(duì)分析，5份NmgroEL基因陽(yáng)性測(cè)序標(biāo)本的基因序列相似性為99.88%～100%。其中，3份黑線姬鼠標(biāo)本(JA4、JA9，KD46)基因序列完全一致, 2份林姬鼠標(biāo)本(JA14、JA23)基因序列基本一致, 與黑線姬鼠標(biāo)本相似性為99.88%。

表1 不同地區(qū)不同鼠種的Nm感染情況

Tab.1 Prevalence ofCandidatusNeoehrlichiamikurensisin rodents from the 3 regions

嚙齒動(dòng)物種 類樣本數(shù)(%)Nm檢出陽(yáng)性率(%)寬甸集安密山感染率黑線姬鼠127(70.17)1/49(2.04)2/39(5.13) 0/39(0)3/127(2.36)林姬鼠24(13.26)0/13(0)2/11(18.18)02/24 (8.33)小林姬鼠1(0.55)0/1(0)000/1(0)大倉(cāng)鼠15(8.29)00/15(0)00/15 (0)褐家鼠13(7.18)0/3(0)0/1(0)0/9(0)0/13 (0)鼩鼱 1(0.55)00/1(0)00/1(0)合計(jì)181(100)1/66(1.52) 4/67(5.97)0/48(0)5/181(2.76)

2.4遺傳進(jìn)化分析 選擇GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Nm注冊(cè)的核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，并以浣熊新埃立克體(CandidatusNeoehrlichialotoris)、嗜吞噬無(wú)形體和查菲埃立克體作為參照。見(jiàn)圖2。進(jìn)化樹分析顯示集安和寬甸的5份鼠標(biāo)本與俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)全溝硬蜱株(FJ966363, FJ966359)及我國(guó)黑龍江省蜱株(JQ359077、KC106716)、黑龍江省Nm感染病人株(JQ359062)同處一個(gè)分枝，歸類于ClusterⅠ。與歐洲Nm株(ClusterⅡ)、我國(guó)西南和東南地區(qū)的Nm株及日本的Nm株(Cluster Ⅲ、Cluster Ⅳ)有較大差異，說(shuō)明Nm基因型分布與地理來(lái)源相關(guān)。

圖2 基于groEL基因部分片段(827 bp)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree ofCandidatus Neoehrlichia mikurensisinferred from 827 bp of thegroELgene sequences

3 討 論

目前，全世界正面臨著新發(fā)傳染病的重大威脅，大部分屬于人獸共患、媒介生物傳播性疾病，而新發(fā)蜱媒病原體(如伯氏疏螺旋體、黑龍江立克次體、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體等)引起的人類疾病即屬于這一范疇。Nm是新發(fā)現(xiàn)的歸屬于無(wú)形體科的蜱媒病原體，巳知硬蜱屬(Ixodesspp.)和嚙齒動(dòng)物分別為其主要的傳播媒介和宿主動(dòng)物[1-2，4-6]。近年來(lái)，在歐洲多個(gè)國(guó)家和地區(qū),澳大利亞、尼日利亞及我國(guó)周邊國(guó)家俄羅斯、日本、蒙古等地均有Nm相關(guān)報(bào)導(dǎo)[1-8]。北美地區(qū)浣熊中發(fā)現(xiàn)了與Nm進(jìn)化關(guān)系較近的病原體，其命名為CandidatusNeoehrlichialotoris[12]。我國(guó)Nm的研究起步較晚，2003年P(guān)an等[13]在廣州褐家鼠(Rattusnorvegicus)脾臟樣本中檢測(cè)到的16S rRNA基因與無(wú)形體科埃立克體屬(Ehrlichia)有明顯區(qū)別，暫命名為Ehrlichiasp.rattus variant[13]。2012年Li等[8]應(yīng)用PCR進(jìn)行鼠中新埃立克體感染調(diào)查, 我國(guó)11個(gè)調(diào)查地區(qū)中有7個(gè)地區(qū)鼠標(biāo)本Nm檢出陽(yáng)性，為我國(guó)多個(gè)地區(qū)可能存在Nm自然疫源地提供了分子流行病學(xué)證據(jù)。目前，世界范圍內(nèi)Nm感染病例報(bào)導(dǎo)較少，自2010年發(fā)現(xiàn)第一例感染患者以來(lái)僅有報(bào)導(dǎo)13例，歐洲散發(fā)病例6例[1，14]，其余7例從我國(guó)黑龍江省牡丹江林區(qū)蜱咬發(fā)熱病人發(fā)現(xiàn)[7]。

Burri等人通過(guò)動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)證明嚙齒動(dòng)物為Nm的動(dòng)物宿主[16], 在歐洲多個(gè)國(guó)家的嚙齒動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)Nm感染，涵蓋6個(gè)鼠種, 不同地區(qū)嚙齒動(dòng)物Nm感染率差異較大, 如德國(guó)感染率高達(dá)52.7%, 而法國(guó)僅1.8%[1，5]。在亞洲，中國(guó)、日本、俄羅斯(西伯利亞和遠(yuǎn)東地區(qū))等多個(gè)地區(qū)的嚙齒動(dòng)物中多個(gè)鼠種存在Nm感染[1，8]。本研究對(duì)我國(guó)東北邊境地區(qū)三個(gè)調(diào)查點(diǎn)進(jìn)行捕鼠采樣，通過(guò)分子生物學(xué)方法調(diào)查鼠中Nm感染情況，從集安和寬甸黑線姬鼠和林姬鼠檢出Nm5份, 感染率為2.76%(5/181), 說(shuō)明野鼠可能是該病原體的重要儲(chǔ)存宿主, 調(diào)查地區(qū)可能存在Nm自然疫源地。Li等報(bào)導(dǎo)[7-8]，我國(guó)不同地區(qū)鼠類Nm感染率為4.0%(1.5%-13.8%), 黑龍江省牡丹江林區(qū)鼠類感染率為3.8%, 本研究結(jié)果(2.76%)與國(guó)內(nèi)報(bào)導(dǎo)基本一致。以往的研究證明，集安和寬甸的不同鼠種攜帶多種蜱媒病原體,包括斑點(diǎn)熱立克次體、查菲埃立克體、無(wú)形體、伯氏疏螺旋體等, 并存在復(fù)合感染[10，15], 本研究從該兩地鼠類檢出了Nm, 說(shuō)明該地區(qū)存在多種蜱媒傳染病并存的自然疫源地。

無(wú)形體科的遺傳進(jìn)化分析主要以groEL基因、rrs基因和gltA基因具有較好的分辨力。Kawahara等采用rrs基因、groEL基因系統(tǒng)發(fā)育分析將Nm歸類為無(wú)形體科一個(gè)新種[2]。2012年Li等[8]依據(jù)rrs基因、groEL基因系統(tǒng)發(fā)育分析可將Nm分為4種基因型，我國(guó)東北地區(qū)以及俄羅斯亞洲地區(qū)的Nm基因型為Cluster I, 歐洲的Nm均為Cluster II, 我國(guó)西南和東南地區(qū)以及源于日本的Nm分別為Cluster III和Cluster IV(圖2), 顯示出基因型分布與地理來(lái)源密切相關(guān)[7]。本研究獲得的NmgroEL基因序列與俄羅斯亞洲地區(qū)以及我國(guó)東北地區(qū)已報(bào)道的序列一致，屬于ClusterⅠ型。

本次研究結(jié)果表明，調(diào)查地區(qū)嚙齒動(dòng)物存在Nm感染，感染率為2.76%，基因型別為ClusterⅠ型, 應(yīng)重視Nm對(duì)人的潛在威脅。Nm作為一種新發(fā)的對(duì)人存在致病性的蜱媒病原體，其流行病學(xué)調(diào)查研究較少，進(jìn)一步開展媒介蜱和嚙齒動(dòng)物Nm流行病學(xué)研究以及感染病例調(diào)查，為自然疫源地確定及該病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無(wú)

本文引用格式：王卓, 王建偉, 于淼, 等. 東北邊境地區(qū)嚙齒動(dòng)物中新埃立克次體感染調(diào)查及groEL基因序列分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2019,35(4): 330-333. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.032