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幾種常用線粒體基因在多房棘球絳蟲蟲種鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀及進展

2019-05-21 08:20334
中國人獸共患病學(xué)報 2019年4期
關(guān)鍵詞:絳蟲宿主線粒體

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泡型包蟲病(Alveolar Echinococcosis, AE)是因感染多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis, Em)續(xù)絳期幼蟲導(dǎo)致的嚴重人獸共患病,未經(jīng)治療的多房棘球蚴病10年的死亡率可達90%,有“惡性包蟲病”或“蟲癌”之稱[1]。AE的傳統(tǒng)診斷方法主要包括剖檢和經(jīng)典沉淀計數(shù)技術(shù)(sedimentation and counting technique, SCT),但存在耗時、費力、操作誤差大等弊端,近些年隨著PCR擴增以及下一代測序技術(shù)(next generation sequencing method, NGS)的應(yīng)用,使多房棘球絳蟲線粒體基因(mtDNA)在棘球絳蟲蟲種鑒定中的應(yīng)用越來越廣泛,不僅克服了傳統(tǒng)方法耗時、費力的缺點,而且可以承受大批量感染宿主的蟲種鑒定工作,甚至將其應(yīng)用到臨床患者的診療中[2-3]。

長期以來,全世界相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者從線粒體基因角度對多房棘球絳蟲分布、多房棘球蚴病防、診、治等進行探索并加以闡釋。下面將近年來線粒體基因在多房棘球絳蟲蟲種鑒定方面的研究綜述如下。

1 多房棘球絳蟲mtDNA簡介

多房棘球絳蟲mtDNA是絳蟲細胞除核基因外的另一重要遺傳物質(zhì),全序列13 738 bp(來自AB018440.2),為多拷貝序列,具有母系遺傳特點,進化速度較核基因快,一般情況下無組織特異性,且易于獲得,重復(fù)性好。與其他扁形動物門物種一樣具有36個編碼基因,其中蛋白質(zhì)編碼基因12個,tRNA編碼基因22個,rRNA編碼基因2個。蛋白質(zhì)編碼基因約占60%,編碼產(chǎn)物為線粒體呼吸鏈的重要組分,主要包括細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase, CcO)基因(cox1、cox2、cox3)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶基因(nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、nad5和nad6)、細胞色素b基因(cob)、ATP合成酶F0亞單位6基因(atp6),缺少較高等動物具有的atp8基因,蛋白質(zhì)編碼基因一般無內(nèi)含子,各編碼基因之間可被tRNA基因或其他非編碼序列間隔[4-6](如圖1)。mtDNA所有基因均位于重鏈上,復(fù)制和轉(zhuǎn)錄按順時針方向進行,與有體腔的后生動物雙向進行不同。雖然多種mtDNA基因可用于蟲種鑒定,但各個基因相互之間有一定區(qū)別[18](見表1)。

圖1 多房棘球絳蟲mtDNA排列順序(未展示tRNA基因)Fig.1 The sequence of mtDNA ofEchinococcus multilocularis(no expressing tRNA genes)

表1 幾種多房棘球絳蟲mtDNA的特點[18]

Tab.1 Characteristics of various mtDNA markers

分子標記特點蛋白編碼基因?保守,用于家族、屬、種等分類的鑒別12S rRNA高度保守,用于門、亞門水平的鑒別16S rRNA用于中間分類水平的鑒別,如家族等非編碼區(qū)高度可變,用于種和亞種的鑒別

注:*包括cox、nad、cob及atp6基因;該表格內(nèi)容主要參考文獻[18]。

下面將分開敘述幾種mtDNA在多房棘球絳蟲蟲種鑒定中的應(yīng)用。

2 Em蟲種鑒定中常用的幾種線粒體基因

2.1cox1基因 多房棘球絳蟲cox1全序列1 608 bp(來自AB461420.1),一般位于mtDNA重鏈tRNATrp和tRNAThr基因之間[7],該基因編碼產(chǎn)物為細胞色素c氧化酶(CcO)亞基1,具有與血紅素和銅離子配位的組氨酸,亞基1分子量較亞基2和3大,進化速度較快[8]。cox1基因不僅變異程度較大,能準確區(qū)分不同種間寄生蟲序列差異,而且其保守區(qū)域可用于精確設(shè)計PCR引物[9]。2003年Hebert[9]提出cox1基因適用于多種動物的種類鑒別,富含多態(tài)位點的cox1片段可作為物種鑒別的DNA條碼(DNA barcoding)。

研究者通過提取宿主糞便和病灶中的棘球絳蟲cox1基因,能夠快速、準確鑒別棘球絳蟲蟲種。Gérald[10]等在法國Em低發(fā)區(qū)紅狐糞便中提取DNA,對cox1基因進行焦磷酸測序,發(fā)現(xiàn)東南部Hautes-Alpes省和北部Seine-Maritime區(qū)域Em感染率分別為2.5%和3.5%。研究者于法國東北部Moselle野生動物園內(nèi)捕捉151只野鼠(voles),解剖獲取病灶組織并利用PCR擴增cox1基因用于Em調(diào)查,感染率5.3%[11]。Leidi[12]等愛沙尼亞寄生蟲調(diào)查,解剖111只紅狐,擴增組織cox1基因,Em感染31.5%。近些年cox1基因擴增方法如限制性片段長度多態(tài)性PCR(RFLP-PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、實時PCR(real time-PCR)、高分辨率溶解PCR(high-resolution melting, HRM-PCR)等應(yīng)用廣泛,使Em蟲種鑒定的敏感性和特異性增加。Guilherme[13]等提出HRM-PCR擴增cox1基因可以使蟲種鑒別更具特異性。cox1為Em蟲種鑒定中應(yīng)用最廣泛的基因之一,其方便設(shè)計引物,擴增結(jié)果可信度高。

2.2nad1基因 全序列長894 bp(來自AB668376.1),一般位于mtDNA重鏈tRNAAsp和tRNAAsn基因之間[7],因多房棘球絳蟲nad1基因存在特異的進化片段,在蟲種鑒定中可區(qū)分同屬但不同種的寄生蟲。研究者對Em線粒體nad1進行擴增,所得結(jié)果與GenBank中收錄的基因同源性達98.8%,與細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus,Eg)基因的同源性約86%,與少節(jié)棘球絳蟲(Echinococcusoligarthrus,Eo)、伏氏棘球絳蟲(Echinococcusvogeli,Ev)的基因同源性約85%,指出Em的nad1基因序列與其他類型的棘球絳蟲nad1序列存在差異,故而可依據(jù)差異片段設(shè)計區(qū)別不同蟲種的引物,在未知類型寄生蟲流行區(qū)篩查是否存在多房棘球絳蟲感染[14]。Mohammad[15]等在伊朗西北部贊詹省進行的紅狐腸內(nèi)寄生蟲鑒別實驗,對nad1基因進行PCR擴增,發(fā)現(xiàn)該地暫無Em感染。除此之外,研究者通過nad1篩查Em發(fā)現(xiàn)了新的中間宿主。研究者在加拿大西南部Alberta地區(qū),提取肝病灶組織DNA,擴增nad1,首次報道了紅背鼠(Myodesgapperi)作為Em中間宿主[16]。雖然nad1擴增可鑒別Em蟲種,但因抑制劑影響PCR擴增造成實驗結(jié)果可靠性下降,C.Klein[17]等發(fā)現(xiàn)將凍融糞便樣品用于擴增nad1基因,可以減少PCR抑制劑的影響,并且PCR敏感度提高20%。

2.312S rRNA基因Em線粒體12S rRNA基因和16S rRNA基因呈串聯(lián)排列,中間被tRNACys基因隔開[7],12S rRNA基因與16S rRNA基因相比更加保守,因此常用于分類水平較高的寄生蟲蟲種鑒定,可在多種寄生蟲混合感染、多變且復(fù)雜的環(huán)境中鑒別蟲種[18-19]。研究者在波蘭東北部Varmia-Masuria省,Anna Lass[20]等地采集103份環(huán)境中的水果、蔬菜和蘑菇樣本,利用巢式PCR(nested-PCR)擴增12S rRNA,發(fā)現(xiàn)野外環(huán)境中Em蟲卵DNA陽性率23.3%。B. Szostakowska[21]等擴增線粒體12S rRNA基因的方法首次在波蘭東北部Varmia-Masuria地區(qū)土壤中發(fā)現(xiàn)有多房棘球絳蟲mtDNA的存在。另外,研究者將12S rRNA序列用于鑒別宿主種類和Em。Anke Dinkel[22]等提取來自不同宿主的犬類糞便DNA,擴增12S rRNA片段,表示實時多重巢式PCR(real-time multiplex-nested PCR, rtm-nested PCR)可同時檢測犬類糞便中Em和宿主種類。

2.416S rRNA基因 16S rRNA基因與12S rRNA基因相鄰,進化速度較12S rRNA快,用于Em蟲種鑒定時常聯(lián)合其他mtDNA。Li[23]等調(diào)查了來自中國西北地區(qū)53例包蟲病患者,提取活檢組織DNA,RFLP-PCR法擴增16S rRNA基因,cob基因測序,確定其中20例為AE患者。16S rRNA的不同擴增方法對Em檢出率不同,周正斌[24]等采用多重PCR(multiplex PCR)、RFLP-PCR和半巢式PCR(hemi-nested PCR)分別擴增Em、Eg、Es和帶科絳蟲的16S rRNA,12 S rRNA和nad1基因,發(fā)現(xiàn)半巢式PCR陽性檢出率最高,解決了PCR擴增抑制,再聯(lián)合限制性酶切技術(shù)可提高Em鑒別的靈敏度和特異性。

2.5其他Em感染蟲種鑒定時涉及的mtDNA 包括cob基因、nad2基因、nad5基因、atp6基因等,這些基因常常并不單獨使用,而是與nad1、cox1等聯(lián)用,從而提高蟲種鑒定的準確性。Leidi Laurimaa[25]等采集愛沙尼亞浣熊腸道樣本,擴增cox1、nad2和cob基因,首次報道了浣熊可能是愛沙尼亞感染AE的重要宿主,其感染率可達1.6%。Liu[26]等運用多重PCR擴增nad1、nad5、cox1片段,可區(qū)別Em、Eg和石渠棘球絳蟲(Echinococcusshiquicus,Es),特異性接近100%。

目前mtDNA主要用于終末宿主感染Em的篩查診斷,如利用糞蟲體來源DNA聚合酶鏈式反應(yīng)檢測法(copro-DNA detection by PCR, Copro-PCR)擴增mtDNA,診斷Em敏感性89%~94%,特異性接近100%[27]。除此以外,中間宿主(不包括人)的診斷也可采用PCR擴增mtDNA聯(lián)合剖檢。雖然包蟲病患者的診斷主要依賴臨床病史、影像學(xué)結(jié)果、血清學(xué)檢驗以及病理學(xué)鏡下特點,但也有部分研究者提取并擴增病灶組織mtDNA用于診斷泡型包蟲病,MA[28]等通過cox1基因擴增調(diào)查青海地區(qū)棘球絳蟲流行現(xiàn)狀,發(fā)現(xiàn)163例包蟲病人中AE感染率為10.4%。

mtDNA用于Em蟲種鑒定,與經(jīng)典SCT法相比較,降低了勞動量,減少了操作時間,避免了不同操作者的影響,尤其當使用SCT法難以辨別蟲種時,依據(jù)不同分類水平特異性擴增所需mtDNA片段,在分子水平上比對Genbank中已存的絳蟲線粒體基因序列,不僅蟲種鑒別的敏感性和特異性接近SCT,同時也可根據(jù)mtDNA推測蟲種來源和可能的傳播方向。

3 存在的問題

雖然mtDNA廣泛應(yīng)用于Em蟲種鑒定,但也存在很多局限。首先,1967年Rausch[29]以及2009年Minoru Nakao[30]對Em分類的建議還并未得到所有研究者的公認,還需進一步對Em蟲株行統(tǒng)一分類,再加上Em蟲株的多樣,許多流行區(qū)域多種單倍型共存,某些新的單倍型被發(fā)現(xiàn),PCR引物設(shè)計缺陷等,導(dǎo)致利用mtDNA進行Em蟲種鑒定存在一些挑戰(zhàn)。

其次,單純使用mtDNA用于蟲種鑒定忽略了核序列的變異情況[31],如核內(nèi)rRNA 基因、衛(wèi)星DNA、RNA聚合酶II第二亞基基因(rpb2)、DNA聚合酶δ亞基基因(pold)等,某些核基因序列還可插入到mtDNA 中,干擾mtDNA序列分析結(jié)果[32]。建議在Em蟲種鑒定時,多采用mtDNA和核基因序列對比分析法[33],目的基因的選擇不要局限于mtDNA中,多層次、多內(nèi)容的分析結(jié)果可能具有更全面的說服力。

再者,mtDNA的全序列研究還較少,多數(shù)研究僅擴增mtDNA部分片段,導(dǎo)致所做結(jié)論說服力有限,難以客觀指導(dǎo)疾病的預(yù)防和診斷。

最后,棘球絳蟲mtDNA的提取及PCR擴增需要具備相關(guān)條件的實驗室才能操作,對操作者也有較高專業(yè)技術(shù)要求,在部分落后地區(qū)難以普及。

4 結(jié)語

mtDNA在多房棘球絳蟲蟲種鑒定中有其獨特的優(yōu)勢,可能在將來Em蟲種鑒定中的應(yīng)用將越來越廣泛,與剖檢、沉淀計數(shù)技術(shù)相互補充,提高蟲種鑒定的準確性,但也存在一些缺陷,另外關(guān)于該基因表達產(chǎn)物的研究還沒有深層次的展開,如何利用mtDNA準確鑒別多房棘球絳蟲還需廣大研究者不懈努力。

利益沖突:無

本文引用格式:王強, 王志鑫, 馬艷艷, 等. 幾種常用線粒體基因在多房棘球絳蟲蟲種鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀及進展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2019,35(4):355-358. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.035

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