孫文超,易馳喆,汪 偉,曹 亮,張世亨,閉璟珊,韋顯凱,辛佳亮,李文杰,張克龍,鄭 敏,魯會(huì)軍,張紅云,蘇姣秀

(1.溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所,浙江 溫州 3250352；2.軍事科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130122；3.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西 南寧 530001；4.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,廣西 南寧 530004)

山羊和綿羊痘病毒屬于痘病毒科,山羊痘屬,該病毒粒子大小為橢圓形,為含囊膜的雙鏈DNA病毒。山羊和綿羊痘病毒是主要感染山羊和綿羊這兩種物種,未見野生偶蹄類動(dòng)物感染病例。山羊和綿羊痘在非洲和亞洲的部分地區(qū)、中東以及印度次大陸的大部分地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)。孟加拉國(guó)每年都會(huì)暴發(fā)山羊和綿羊痘,導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。該疫情主要見于冬末和秋末(當(dāng)年10月份至次年4月份)。病毒經(jīng)常在緊密接觸時(shí)通過(guò)呼吸道傳播,也可通過(guò)其他黏膜或磨損皮膚感染。病毒在唾液、鼻腔和結(jié)膜分泌物、乳汁、尿液和糞便以及皮膚損傷和結(jié)痂中經(jīng)常檢測(cè)到。黏膜上的潰瘍是病毒擴(kuò)散的重要來(lái)源。

使用減毒或滅活疫苗可能有助于預(yù)防和控制山羊和綿羊痘。然而目前關(guān)于羊痘病毒引起的相關(guān)炎性細(xì)胞因子和抗病毒因子的研究相對(duì)較少,本研究建立羊炎性因子(IL-1β和IL-8)和Mx1因子實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法,為山羊痘感染后的羊炎性和抗病毒因子在mRNA水平研究提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑 外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒,購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；總RNA抽提試劑盒,購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒,購(gòu)自杭州愛思進(jìn)生命科學(xué)有限公司；ConA,購(gòu)自碧云天生物科技研究所；MLV Reverse Transcriptase、SYBR Green Real-time PCR Master Mix,均購(gòu)自Promega公司。

1.2 毒株、菌株和載體 山羊痘AV41株由廣西壯族自治區(qū)疫控中心保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 儀器 Nanodrop 2000分光光度計(jì)、ABI Prismr 7500型熒光定量 PCR儀,均購(gòu)自賽默飛Thremo公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中羊IL-1β、IL-8和Mx1因子基因序列,利用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExpress和Oligo7分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物序列(見表1),以上引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 Real-time PCR引物

1.4.2 cDNA樣品的制備 無(wú)菌采集健康山羊抗凝血20 mL,分離外周血單核細(xì)胞。同時(shí)用Con A和PHA刺激12 h后加入TRIZol收集樣品提取總RNA,將樣品反轉(zhuǎn)錄后所得 cDNA置于 -20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 基因克隆 以制備的cDNA樣品為模板進(jìn)行IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,膠回收純化后連接到pMD-18T載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,LB平板上培養(yǎng)12 h,挑取單菌落,37℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)12 h后小量提取質(zhì)粒,酶切鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序鑒定,將陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)分別測(cè)量濃度,根據(jù)換算公式計(jì)算各樣品中重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。IL-1β、IL-8和Mx1拷貝數(shù)分別是4.7×1010Copies/μL、9.32×109Copies/μL、9.97 ×109Copies/μL。 然后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10倍梯度稀釋,取不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品為模板,對(duì)引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,篩選出最佳反應(yīng)條件。隨后以不同稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進(jìn)行正式試驗(yàn),Real-time PCR用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL；上游/下游引物各1 μL；模板1 μL；蒸餾水7 μL。系統(tǒng)將自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率以及熔解曲線。

1.4.6 靈敏度試驗(yàn)以及重復(fù)性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10倍梯度稀釋,共稀釋12個(gè)梯度。用稀釋的樣品模板(同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng),每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),檢驗(yàn)該方法能檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為對(duì)照計(jì)算組間及組內(nèi)的變異系數(shù),分析試驗(yàn)的重復(fù)性。

1.4.7 山羊外周血淋巴細(xì)胞因子mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 利用本試驗(yàn)利用羊痘病毒AV41株和Con A分別刺激山羊外周血淋巴細(xì)胞因子,通過(guò)對(duì)IL-1β、IL-8和 Mx1細(xì)胞因子 mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 羊細(xì)胞因子基因片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 利用山羊外周血提取cDNA為模板基因組為模板,以IL-1β、IL-8和Mx1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增IL1β、IL-8和Mx1基因。結(jié)果顯示,各自的目的片段與預(yù)期大小一致(圖1)。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建羊IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 細(xì)胞因子的PCR鑒定結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及熔解曲線分析 最終確定優(yōu)化的反應(yīng)體系如下：10 pmol/L上、下游引物各1 μL、2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL、模板1 μL,去離子水補(bǔ)至20 μL。 羊 IL-1β、IL-8 和 Mx1細(xì)胞因子重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度系列稀釋,分別選取不同濃度的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,同時(shí)每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果表明羊IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,R2均大于0.990(圖2)。

2.3 特異性檢測(cè)結(jié)果 用建立的SYBR Green I熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),結(jié)果顯示未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,只有1個(gè)特異性峰Tm值介于82.5℃～85.5℃之間,無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。

2.4 敏感性檢測(cè)結(jié)果 以10倍系列稀釋的質(zhì)粒DNA為模板,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR。結(jié)果顯示,IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子檢測(cè)體系檢出下限分別為4.7×103Copies/μL、9.32×103Copies/μL、9.97 ×101Copies/μL。

2.5 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果 將不同稀釋度羊IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR,用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析結(jié)果,表明建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法組間變異系數(shù)為0.664% ～1.09%,組內(nèi)變異系數(shù)為0.77% ～1.56%,組內(nèi)和組間變異系數(shù)均在2%以內(nèi)表明重復(fù)性和穩(wěn)定性好。

圖2 IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 羊IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子熒光定量PCR檢測(cè)重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 山羊外周血淋巴細(xì)胞因子mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果 本試驗(yàn)利用羊痘病毒AV41株和Con A分別刺激山羊外周血淋巴細(xì)胞,通過(guò)對(duì)IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子mRNA熒光定量檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明,山羊外周血淋巴細(xì)胞中羊炎癥因子IL-1β和IL-8 mRNA表達(dá)水平與Con A對(duì)照組相比均有明顯差異,羊痘感染可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生大量的炎癥因子。羊痘感染組Mx1細(xì)胞因子明顯低于Con A對(duì)照組,表明羊痘病毒在復(fù)制過(guò)程中可能抑制了機(jī)體的先天免疫應(yīng)答(圖3)。

圖3 山羊外周血淋巴細(xì)胞因子mRNA表達(dá)分析

3 討論

I型干擾素(IFN)是天然免疫反應(yīng)的重要介質(zhì),對(duì)于限制病毒的早期復(fù)制和傳播至關(guān)重要。I型IFN的重要下游效應(yīng)因子是黏病毒抗性基因(小鼠和豬Mx1、人MxA)[1]。Mx基因幾乎存在于從魚類到靈長(zhǎng)類動(dòng)物的所有脊椎動(dòng)物的基因組[2]。不同物種的Mx蛋白具有不同的抗病毒活性,并且Mx蛋白的亞細(xì)胞定位有助于抗病毒作用[3]。IFN-α/β、雙鏈RNA或病毒感染能夠誘導(dǎo)Mx1的高水平表達(dá)[4]。Mx1蛋白可以在體內(nèi)外抑制多種病毒的生長(zhǎng),包括正黏病毒、布尼亞病毒、彈狀病毒、副黏病毒和漢坦病毒[5]。研究表明,Mx1/MxA蛋白通過(guò)直接抑制病毒基因組的復(fù)制來(lái)發(fā)揮其抗病毒作用,因此Mx1具有廣譜的抗病毒活性。炎癥反應(yīng)在病毒感染過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。白細(xì)胞介素IL-1β(Interleukin-1β,IL-1β)是主要的炎性細(xì)胞因子之一[6],IL-1β在炎癥反應(yīng)中是通過(guò)上調(diào)炎癥基因基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)介導(dǎo)[7]。MMPs主要降解細(xì)胞外基質(zhì)組分。基質(zhì)金屬蛋白酶在生理和病理過(guò)程中均參與ECM的重塑,包括器官產(chǎn)生/再生、血管生成、傷口愈合、炎癥和腫瘤生長(zhǎng)都是非常重要的[8]。此外,MMP-9涉及多種病理狀況,如研究發(fā)現(xiàn),這種高表達(dá)促炎性細(xì)胞因子血癥對(duì)流感病毒感染的宿主防御反應(yīng)。然而,高水平的促炎性細(xì)胞因子的存在會(huì)損害線粒體的能量代謝,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和器官衰竭。白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8),又稱為趨化因子8(CXCL8)[9]。早期研究發(fā)現(xiàn),IL-8是內(nèi)皮細(xì)胞的趨化和生長(zhǎng)因子,后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)IL-8的受體CXCR1和CXCR2結(jié)合從而使中性粒細(xì)胞趨化到反應(yīng)部位,實(shí)現(xiàn)機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)[10]。CXCR1和CXCR2受體也在各種腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)可以高親和力結(jié)合IL-8[11]。

實(shí)時(shí)PCR熒光標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR相比敏感度高、省時(shí)、方便。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在流感病毒A和B、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等的檢測(cè)和鑒別。本研究建立羊IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子的Real-time PCR檢測(cè)方法,Tm值介于82.5℃～85.5℃之間；重復(fù)性良好,組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%；IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子檢測(cè)體系檢出下限分別為 4.7×103Copies/μL、9.32×103Copies/μL、9.97 × 101Copies/μL。 山羊炎癥因子IL-1β、IL-8 mRNA水平均顯著高于 ConA對(duì)照組,證實(shí)羊痘感染可以刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的炎癥因子。而羊Mx1細(xì)胞因子與Con A對(duì)照組相比均有明顯較低,可能羊痘病毒在復(fù)制過(guò)程存在抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗病毒作用。例如羊痘病毒編碼的N1蛋白同時(shí)具有抑制宿主細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的能力。然而目前關(guān)于羊痘病毒的分子機(jī)制還不是很清楚。本研究利用熒光定量方法檢測(cè)羊痘病毒IL-1β、IL-8和Mx1細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平,為研究山羊痘感染后分子免疫機(jī)制的提供了可靠的技術(shù)支撐。