王金合,雷連成

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046；2.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062)

對蛋雞免疫功能的評價,一是通過評價細(xì)胞免疫功能,主要評價T、B淋巴細(xì)胞的數(shù)量及活化程度；二是體液免疫評價,主要評價抗體效價；三是免疫器官變化,主要評價免疫器官指數(shù)胸腺、脾臟、腔上囊指數(shù)等的變化,其發(fā)育狀況直接影響到動物機體的免疫力[1]；四是評價體液中的細(xì)胞因子、補體系統(tǒng)等變化。

益生菌能有效地提高巨噬細(xì)胞和干擾素的活性,是良好的免疫激活劑,能激發(fā)機體體液免疫和細(xì)胞免疫,導(dǎo)致動物機體免疫力的增強[2]。鋅能夠維持動物體免疫器官的正常組織結(jié)構(gòu)和生長發(fā)育,低鋅則引致禽類的腔上囊、胸腺、脾臟等免疫器官重量減輕、器官萎縮及生長發(fā)育不良；鋅中毒狀態(tài)時,黏膜表面sIgA減少,黏膜免疫功能削弱,缺鋅對T淋巴細(xì)胞功能、B淋巴細(xì)胞的功能均有影響[3-4]。本試驗通過益生菌將硫酸鋅轉(zhuǎn)化為有機鋅,研究對蛋雞免疫功能的影響,以期為臨床開發(fā)應(yīng)用富鋅益生素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

1.1.1 活化培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基 產(chǎn)朊假絲酵母活化培養(yǎng)基：蛋白胨 5.0 g、葡萄糖 10.0 g、酵母膏3.0 g、麥芽浸膏 3.0 g、瓊脂 20.0 g、蒸餾水1 000 mL,自然pH值；產(chǎn)朊假絲酵母種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、KH2PO42g,MgSO4·7H2O 0.3 g、蒸餾水1 000 mL,自然pH值。嗜酸乳桿菌活化培養(yǎng)基：10%脫脂乳培養(yǎng)基,自然pH值；嗜酸乳桿菌種子培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基(上海易利生物科技有限公司)。凝結(jié)芽孢桿菌活化培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；凝結(jié)芽孢桿菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、蒸餾水1 000 mL,pH值7.5。

1.1.2 復(fù)合菌發(fā)酵培養(yǎng)基 參照文獻[5],確定以上三種復(fù)合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成：麥麩18 g,玉米皮粉7.5 g,豆粕4.5 g,麥芽糖0.45 g,紅糖0.74 g,NH4Cl 0.3 g,(NH4)2SO40.3 g,CaCO30.15 g,KH2PO40.29 g,MnSO40.08 g,MgSO40.15 g,自然pH值,含水量(即干物料質(zhì)量∶水的體積)為1∶0.8。流通蒸汽滅菌。

1.1.3 計數(shù)培養(yǎng)基 GYP白亞瓊脂培養(yǎng)基(嗜酸乳桿菌)、YPD固體培養(yǎng)基(產(chǎn)朊假絲酵母)、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(凝結(jié)芽孢桿菌)計數(shù)培養(yǎng)基,均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 全自動酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK Synergy H1M)；超凈工作臺(蘇州凈化SW-CJ-2D)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國美墨爾特INC153med)；臺式高速冷凍離心機(德國Sigma 3-k30)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠,LDZM-60KCS)等。

1.3 富鋅活菌制劑的制備 選擇產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌三種益生菌為生產(chǎn)菌。將產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌菌種分別接種于斜面活化培養(yǎng)基上連續(xù)活化2～3次；再按照3%接種量接種于種子培養(yǎng)基中。產(chǎn)朊假絲酵母30℃ 160 r/min搖床培養(yǎng)13 h,嗜酸乳桿菌37℃160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。凝結(jié)芽孢桿菌37℃200 r/min搖床培養(yǎng)24 h,分別獲得3種益生菌的種子液。配置鋅濃度為50 mg/mL的硫酸鋅溶液[6],121℃高壓滅菌30 min后備用。將硫酸鋅溶液按照1∶200的比例加入復(fù)合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,將產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌種子液接種比例按1∶1∶1接種于復(fù)合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,攪拌均勻后裝入淺盤35℃培養(yǎng)36 h,淺盤表面及內(nèi)層長滿菌體后溫度提高至60℃,加大風(fēng)量,干燥后得到富鋅益生素。檢測其活菌數(shù)及有機鋅轉(zhuǎn)化率。

1.4 試驗動物及分組 選取1周齡海藍褐蛋雞120只,試驗隨機分為4組(每組3個重復(fù))：對照組(Ⅰ組)；試驗(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)分別按照基礎(chǔ)日糧的0.1%、0.15%、0.2%比例添加富鋅益生素。試驗時間為55 d,其中預(yù)試驗5 d。常規(guī)飼養(yǎng)管理,蛋雞基礎(chǔ)日糧由新希望集團提供,飼喂方式采用自由采食和自由飲水,試驗地點位于河南省駐馬店某蛋雞場。

1.5 檢測指標(biāo)和方法

1.5.1 活菌數(shù)及有機鋅轉(zhuǎn)化率檢測取10 g富鋅益生素,用滅菌生理鹽水做10倍梯度稀釋,分別取不同稀釋度益生素稀釋液0.1 mL,均勻涂布于不同菌種固體培養(yǎng)基,每個稀釋度3個重復(fù),以每個平板上生長30～300個菌落作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn),培養(yǎng)后活菌計數(shù)。有機鋅轉(zhuǎn)化率測定參照文獻[7]的方法,采用原子吸收分光光度法測定鋅含量。富鋅益生素1∶5稀釋后,3000 r/min離心8 min,分別測定沉淀物和上清液鋅含量,有機鋅轉(zhuǎn)化率=沉淀物鋅含量/總鋅含量×100%。

1.5.2 免疫器官指數(shù) 分別在21、42日齡,每組隨機選取4只雞,稱重?fù)錃?采集胸腺、腔上囊、脾臟。計算出胸腺、脾臟、腔上囊的免疫器官指數(shù)。免疫器官數(shù)=免疫器官重(mg)/體重(g)。

1.5.3 血清補體C3、C4、IL-2、IFN-γ含量的檢測分別在21日齡、28日齡、35日齡,每組隨機抽取4只雞,采取翅靜脈采血,每只采集5 mL血液,分離血清,檢測血清補體 C3、C4、IL-2、IFN-γ含量。 補體C3、C4、IFN-γ 的含量用通蔚試劑(上海)有限公司ELISA試劑盒測定；IL-2使用上海鈺博生物科技有限公司試劑盒測定；檢測方法按照說明書進行。

1.5.4 外周血T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率用MTT法測定。在21日齡和42日齡每個重復(fù)選取2只健康蛋雛雞,翅靜脈采集抗凝血5 mL,分離出淋巴細(xì)胞,分別用 Con A、LPS(南京生興生物技術(shù)有限公司)為T淋巴細(xì)胞的刺激源、B淋巴細(xì)胞的刺激源。將分離的T、B淋巴細(xì)胞在CO2恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48小時,酶標(biāo)儀測定OD值(570 nm),計算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)=絲裂原刺激OD值/對照OD值,以淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)表示結(jié)果。

1.5.5 體液免疫水平的測定(對ND影響) 試驗用雛雞于8日齡、22日齡用雞新城疫活疫苗(LaSota株,乾元浩生物股份有限公司)免疫,滴鼻點眼(2羽份)；分別于28日齡、42日齡、56日齡采血分離血清,采用HI試驗檢測雞ND抗體效價,結(jié)果以log2表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件統(tǒng)計,單因子方差(One-WayANOVA)分析進行差異顯著性檢驗,用 Duncan法進行多重比較。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 富鋅益生素活菌數(shù)及鋅轉(zhuǎn)化率 產(chǎn)朊假絲酵母每克含活菌5.20×108CFU/g,嗜酸乳桿菌每克含活菌6.40×108CFU/g,凝結(jié)芽孢桿菌每克含活菌7.91×109CFU/g,富鋅益生素總活菌數(shù)為9.07×109CFU/g,有機鋅轉(zhuǎn)化率為76.82%。

2.2 免疫器官指數(shù) 由表1可知,21日齡和42日齡,益生素添加組的脾臟指數(shù)、腔上囊指數(shù)、胸腺指數(shù)均高于對照組。21日齡時,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的脾臟指數(shù)分別高出Ⅰ組 9.47%(P＞0.05)、22.1%(P＜0.05)、23.51%(P＜0.05)；胸腺指數(shù)分別高出Ⅰ組7.94%(P ＞0.05)、16.33%(P ＜0.05)、19.86%(P＜0.05)；腔上囊指數(shù)分別高出Ⅰ組2.48%(P＞0.05)、9.94%(P ＞0.05)、16.57%(P ＜0.05)。 42日齡時,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的脾臟指數(shù)分別高出Ⅰ組2.48%(P ＞0.05)、7.12%(P ＞0.05)、13.03%(P＞0.05)；胸腺指數(shù)分別高出Ⅰ組1.70%(P＞0.05)、7.18%(P ＞0.05)、10.39%(P ＞0.05)；腔上囊指數(shù)分別高出Ⅰ組0.48%(P＞0.05)、1.19%(P ＞0.05)、6.22%(P ＞0.05)。

表1 富鋅益生素對蛋雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 血清補體 C3、C4、IL-2、IFN-γ含量 由表2可知,C3、C4檢測值各組在21日齡、28日齡、42日齡變化不明顯(P＞0.05)。相同日齡富鋅益生素添加組和對照組相比,C3含量顯著提高(P＜0.05)；IL-2檢測值在21日齡、28日齡、42日齡Ⅰ組、Ⅱ組變化不大(P＞0.05),Ⅲ組42日齡顯著提高(P＜0.05),Ⅳ組在28日齡、42日齡顯著提高(P＜0.05)；同日齡IL-2檢測值,Ⅲ組、Ⅳ組對Ⅰ組、Ⅱ組均有顯著提高(P＜0.05)。IFN-γ檢測值Ⅰ組在21日齡、28日齡、42日齡變化不大(P＞0.05),Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組對Ⅰ組均有顯著提高(P＜0.05)；同日齡IFN-γ檢測值,21日齡、28日齡Ⅳ組在對其他各組均有顯著提高(P＜0.05),在42日齡,Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組均對Ⅰ組有顯著提高(P＜0.05)。

表2 富鋅益生素對血清補體C3、C4、IL-2、IFN-γ含量的影響

2.4 外周血T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 由表3可知,21日齡、42 d的Ⅲ組、Ⅳ組的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組Ⅰ和試驗Ⅱ組(P＜0.05)；B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率各組差異均不顯著(P＞0.05)。

表3 富鋅益生素對蛋雞淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

2.5 對ND抗體水平的影響 由表4可知,Ⅲ組、Ⅳ組ND的HI抗體效價在42日齡、56日齡顯著高于對照組(P＜0.05)。

表4 富鋅益生素對ND抗體水平的影響

3 討論

有益菌在腸道內(nèi)大量繁殖并不斷合成有益物質(zhì),能夠促進動物免疫器官生長發(fā)育,能夠發(fā)揮免疫佐劑的作用,活化機體免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)免疫功能[8]。適量的鋅對免疫機能必不可少,能夠保證免疫系統(tǒng)的完整性,對動物機體免疫功能的穩(wěn)定起著重要的作用,鋅嚴(yán)重缺乏影響動物免疫器官生長發(fā)育,影響胸腺素生物學(xué)活性作用的發(fā)揮[9]。盧昊等[10](2010)發(fā)現(xiàn),在肉雞日糧飼料中添加谷氨酸絡(luò)合鋅,脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于對照組。本試驗結(jié)果表明,添加富鋅益生素增加機體免疫功能。益生素添加組的脾臟指數(shù)、腔上囊指數(shù)、胸腺指數(shù)均高于對照組,提高了蛋雛雞血清C3、C4 含量,能顯著提高 IL-2、IFN-γ 含量,表明富鋅益生素能促進機體補體產(chǎn)生。IFN-γ含量的提高,活化了T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生,提高了單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力、增強了Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性、抗病毒和抗腫瘤等作用。IL-2含量的提高,活化了T淋巴細(xì)胞,促進細(xì)胞因子產(chǎn)生,刺激NK細(xì)胞增殖,增強NK殺傷活性及產(chǎn)生細(xì)胞因子,誘導(dǎo)LAK細(xì)胞產(chǎn)生；促進B淋巴細(xì)胞增殖和分泌抗體；激活巨噬細(xì)胞[11]。當(dāng)淋巴細(xì)胞受到抗原或絲裂原(如 Con A、LPS)等刺激后,引起淋巴細(xì)胞的代謝和形態(tài)發(fā)生改變,轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞發(fā)生分裂增殖,根據(jù)T、B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率可以判定機體的體液免疫和細(xì)胞免疫狀況[12]。張春善等[13](2000)補鋅能提高淋巴細(xì)胞PHA刺激轉(zhuǎn)化率。趙波等[14](2005)研究表明,蛋氨酸鋅可提高蛋雞的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。呂英[15](2003)研究表明,乳酸菌可以激活免疫細(xì)胞,提高外周血液中T淋巴細(xì)胞的增殖,提高細(xì)胞免疫水平?？贵w滴度水平的高低反應(yīng)了家禽的健康狀況和體液免疫的強弱[16]。閆素梅等[17](2002)研究發(fā)現(xiàn),艾維茵肉雞鋅的缺乏,可導(dǎo)致機體體液免疫水平下降,補鋅能夠提高肉雞免疫功能。王斯佳[18](2002)發(fā)現(xiàn),日糧鋅水平對雞血清ND抗體滴度,具有顯著影響。王明發(fā)等[19](2016)研究發(fā)現(xiàn),隨著鋅添加水平的提高,AA肉雞和固始雞ND抗體水平提高極顯著。本試驗結(jié)果表明,蛋雞日糧中添加富鋅益生素能顯著提高外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和ND抗體水平,與上述報道基本一致。

4 小結(jié)

結(jié)果表明,蛋雞日糧添加富鋅益生素提高了脾臟指數(shù)、腔上囊指數(shù)、胸腺指數(shù)及血清 C3、C4、IL-2、IFN-γ的含量,能夠增強蛋雛雞的免疫功能。