扆妍妍,侯雅鑫,張宇瞳,孫 娜,孫耀貴,李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山西 太谷 030801)

卵巢顆粒細胞是組成卵泡的重要體細胞,主要參與調(diào)控卵泡生長發(fā)育、類固醇激素生成等重要生理過程[1-4]。在動物一生中,卵巢不同發(fā)育階段的超過99%的卵泡將在排卵前發(fā)生退化或卵泡閉鎖,只有大約1%的卵泡能成功排卵[5]。而顆粒細胞凋亡被認為是卵巢卵泡閉鎖的主要機制,在卵泡命運中起關(guān)鍵作用[6]。同時顆粒細胞的異常會引起不同生殖疾病,對于畜禽繁殖造成極大的影響[7-8]。因此顆粒細胞的體外培養(yǎng)對于研究畜禽生殖疾病等至關(guān)重要。本試驗通過體外培養(yǎng)小鼠、雞不同等級卵泡顆粒細胞,分析不同種屬動物體外分離、培養(yǎng)顆粒細胞的方法差異,并進行適當(dāng)優(yōu)化,為培養(yǎng)不同畜禽卵巢顆粒細胞提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3周齡雌性昆明系小鼠,SPF級,由北京市昌揚西山養(yǎng)殖場提供。200日齡海藍褐蛋雞,由太谷縣北洸規(guī)范化商品蛋雞養(yǎng)殖場提供。

1.2 試驗試劑與儀器 孕馬血清促性腺激素,購自寧波三生藥業(yè)有限公司；DME/F-12 1∶1(1X)培養(yǎng)基和M199培養(yǎng)基,購自Hyclone公司；Ⅱ型膠原酶、鼠尾膠原、青鏈霉素混合液、細胞組織固定液、正常山羊血清、Triton-100,購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清,購自以色列Biological Industries公司；激光共聚焦35皿,購自NEST公司；Mouse Anti-rabbit IgG/FITC antibody、FSHR Antibody Rabbit Polyclonal,購自武漢 Proteintech公司；DAPI染色液,購自Beyotime公司；主要儀器有離心機(德國Sigma公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(中國 Heal force 公司)。

1.3 主要試劑配制 小鼠卵巢顆粒細胞培養(yǎng)-完全培養(yǎng)基：DME/F-12 1∶1(1X)+10% 胎牛血清+1%青鏈霉素混合液；操作液；DME/F-12 1∶1(1X)+3%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液；雞卵泡顆粒細胞培養(yǎng)；完全培養(yǎng)基：M199+10% 胎牛血清+1%青鏈霉素混合液。

1.4 小鼠卵巢顆粒細胞的分離及原代培養(yǎng) 選取發(fā)情前期的3周齡雌性昆明系小鼠,腹腔注射8 IU孕馬血清促性腺激素(PMSG),46～48 h后頸椎脫臼處死,75%酒精棉球腹部消毒；無菌條件下將小鼠沿腹中線處剪開,充分暴露腹部,切開腹膜,將內(nèi)臟向上翻,暴露兩側(cè)卵巢和輸卵管；用眼科鑷夾住子宮與輸卵管連接部位,將包裹卵巢的膜撕開,眼科鑷夾住,即可取出雙側(cè)卵巢,迅速放入含有PBS(37℃預(yù)熱)的35 mm培養(yǎng)皿中,用PBS清洗3次,轉(zhuǎn)入含有操作液的35 mm培養(yǎng)皿中,若所需卵巢數(shù)量較多,采集應(yīng)分批進行并將已采集卵巢組織置于37℃培養(yǎng)箱中保存；用1 mL的注射器針頭刺破卵巢上卵泡,使得顆粒細胞釋放出來；200目過濾操作液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,PBS清洗3次,1000 r/min離心5 min,加入完全培養(yǎng)基DMEM/F12重懸；吸取臺盼藍溶液按1∶9比例加入細胞懸液中染色,血球計數(shù)板計活細胞數(shù),調(diào)整細胞數(shù)量,按照5×105/mL細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,混勻,放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細胞貼壁及生長情況。

1.5 雞等級卵泡顆粒細胞的分離及原代培養(yǎng) 產(chǎn)蛋高峰期蛋雞,禁食禁水12 h,頸靜脈放血致死,取出卵巢組織,生理鹽水清洗3遍,置于盛有預(yù)冷PBS的滅菌燒杯中；將大于9 mm的卵泡分離到含有預(yù)冷PBS的玻璃皿中,剝離卵泡外膜、結(jié)締組織及血管網(wǎng),在卵泡上剪開一個1 cm左右的小口,將大部分卵黃倒出,用眼科鑷從開口處將卵泡外翻,可見一層透明膜,即為顆粒層；PBS沖洗分離的顆粒層,盡量將卵黃漂洗干凈,轉(zhuǎn)移至安瓿瓶中；將顆粒層剪碎至1 mm3以下,加入適量Ⅱ型膠原酶,放入37℃培養(yǎng)箱中消化5 min,每隔1 min晃動安瓿瓶使消化均勻,消化完畢后加入與等體積預(yù)冷M199培養(yǎng)基終止消化；200目濾網(wǎng)過濾至10 mL EP管中,1 000 r/min離心8 min,棄上清,加入M199培養(yǎng)基重懸,再次離心,重復(fù)兩次,以除去殘余酶液及雜質(zhì)；臺盼藍染色后計活細胞數(shù),按8×105個/mL接種于6孔板內(nèi),24 h后觀察細胞生長狀況。

1.6 雞小黃卵泡顆粒細胞的分離及原代培養(yǎng) 蛋雞選取參考1.5,在無菌的條件下,取8～10枚小黃卵泡,PBS清洗干凈,除去周圍結(jié)締組織；用剪刀將小黃卵泡剪開一個小口,輕輕按壓卵泡,釋放卵黃,PBS清洗兩次,盡可能地去除卵黃顆粒；將清洗后的卵泡轉(zhuǎn)移至安瓿瓶中,剪成1 mm3左右大小的組織塊；加入適量的12.5 μg/mLⅡ型膠原酶,37℃消化8～10 min,之后加入等量的M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化；200目濾網(wǎng)過濾,1 000 r/min離心8 min,棄上清；M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸顆粒細胞,1 000 r/min離心8 min,棄上清,基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗兩次,除去殘存的膠原酶；使用M199完全培養(yǎng)基重懸細胞；臺盼藍染色計活細胞數(shù),細胞存活率在90%以上,按5×105個/mL接種于用鼠尾膠原預(yù)鋪的6孔板內(nèi),24 h后觀察細胞生長狀況。

1.7 顆粒細胞的鑒定

1.7.1 H.E.染色 取生長旺盛第5天的小鼠卵巢顆粒細胞、第3天的雞等級卵泡顆粒細胞使用0.25%含EDTA的胰酶在37℃培養(yǎng)箱中消化30 s,棄去胰酶,使用培養(yǎng)基終止消化并重懸細胞,接種于細胞爬片上,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后PBS清洗3 min×3次；4%多聚甲醛4℃固定20 min,PBS清洗3 min×3次；H.E.染色：蘇木精染色2 min,1%鹽酸分化30 s,氨水返藍2 min；梯度酒精脫水：70%乙醇2 min→80%乙醇2 min→90%乙醇2 min→95%Ⅰ乙醇4 min→95%Ⅱ乙醇4 min→100%Ⅰ乙醇5 min→100%Ⅱ乙醇5 min→二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ10 min；中性樹脂封片,顯微鏡下觀察。

1.7.2 FSHR的表達鑒定 將胰酶消化后的細胞接種于細胞爬片上,培養(yǎng)48 h后取出爬片,PBS洗滌3 min×3次；冰無水乙醇4℃固定20 min,PBS清洗3 min×3次；0.2%Triton×-100細胞通透液,在室溫條件下?lián)u床上孵育通透15 min,PBS清洗3 min×3次；3%正常山羊血清37℃封閉30 min,PBS清洗3 min×3次；加入100 μL FSHR兔多克隆抗體(1∶50),37℃孵育2 h,PBS清洗5 min×3次；加入100 μL FITC標(biāo)記的鼠抗兔抗體(1∶100),37℃孵育1 h,PBS清洗5 min×3次；使用抗熒光衰減封片劑(DAPI)封片,激光共聚焦拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同種屬卵巢顆粒細胞分離培養(yǎng)方法比較及優(yōu)化

表1 雞、小鼠卵巢顆粒細胞提取方法比較

由表1可知,小鼠與雞不同等級卵巢顆粒細胞的提取方法不同,且操作過程中需要的培養(yǎng)基及操作液也不相同。采用合適的方法提取不同種屬卵巢顆粒細胞對于體外培養(yǎng)顆粒細胞尤其重要。

同時在試驗過程中對提取步驟進行優(yōu)化,將取出的小鼠卵巢放置于含有胎牛血清的操作液中進行刺破以釋放顆粒細胞,與在只含有PBS的操作液中刺破卵泡相比,24 h細胞貼壁增多,48 h生長良好,對比培養(yǎng)結(jié)果見圖1。培養(yǎng)雞小黃卵泡顆粒細胞時,將細胞分別接種于鼠尾膠原預(yù)鋪板和普通細胞培養(yǎng)板,普通板細胞24 h也均貼壁完全,但貼壁狀況與鼠尾膠原預(yù)鋪板相比,貼壁較差,細胞較少,圖2為培養(yǎng)48 h后細胞生長狀態(tài)對比結(jié)果。鼠尾膠原預(yù)鋪板細胞24 h時均已貼壁,生長狀況良好；24～48 h期間,細胞迅速增長,48 h時,細胞鋪滿6孔板整個孔,見圖3。

2.2 不同種屬卵巢顆粒細胞形態(tài)學(xué)比較 由圖3可知分離提取出的小鼠卵巢、雞等級卵泡、雞小黃卵泡顆粒細胞在24 h觀察時均貼壁完全,且分離出的顆粒細胞所含雜質(zhì)較少,48 h后細胞舒展,快速生長。表2為小鼠卵巢顆粒細胞、雞等級卵泡顆粒細胞和雞小黃卵泡顆粒細胞培養(yǎng)時細胞形態(tài)及生長特點的差異?？芍煌N屬或相同種屬不同等級卵泡顆粒細胞生長狀態(tài)均存在差異。

圖1 小鼠卵巢顆粒細胞不同操作液培養(yǎng)48 h細胞生長狀態(tài)

圖2 不同條件下雞小黃卵泡顆粒細胞生長48 h狀態(tài)

圖3 不同種屬卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

表2 雞、小鼠卵巢顆粒細胞生長特點

2.3 顆粒細胞的鑒定 H.E.染色結(jié)果顯示(見封二彩版圖4),小鼠卵巢顆粒細胞貼壁后形態(tài)完整,大小均一,呈多角形或者梭形,細胞核深染呈橢圓形,胞漿染為淡紅色。雞等級卵泡和小黃卵泡顆粒細胞H.E.染色結(jié)果顯示細胞形態(tài)完整,邊緣清晰,呈短梭形或多角形,細胞核藍色深染,胞漿淡染。

圖4 不同種屬卵巢顆粒細胞 (H.E.染色)

FSHR為卵巢顆粒細胞特異性表達蛋白,定位于胞漿,見封二彩版圖5可知,綠色熒光均勻分布于胞漿中,細胞核染色清晰,結(jié)果顯示大于95%的細胞被染上綠色熒光,為陽性結(jié)果。因此可鑒定所培養(yǎng)細胞均為卵巢顆粒細胞,且純度達到95%以上。小鼠與雞顆粒細胞的鑒定均以FSHR為標(biāo)準。

圖5 卵巢顆粒細胞FSHR蛋白的表達與定位

3 討論

卵巢顆粒細胞的體外培養(yǎng)為研究卵泡閉鎖、生殖相關(guān)疾病提供了一個良好的體外研究體系。參照已有相關(guān)的文獻,本實驗采用機械法分離培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細胞[9-10]。張春燕等人報道[11],超排效果隨著年齡的增長而下降,性未成熟時超排效果較好。試驗選取3周齡性未成熟小鼠,卵巢上基本上是未充分發(fā)育的初級卵泡,此階段注射PMSG,大量原始卵泡開始同步發(fā)育,可以盡可能獲得多的生長發(fā)育相對一致顆粒細胞[12],確保后續(xù)實驗的進行。朱娜等人[13]報道,不同發(fā)情周期超排效果不同,在發(fā)情期、后期與間期進行超排,均可出現(xiàn)數(shù)量不等的黃體,發(fā)情前期注射PMSG 48 h后,可見較多的有腔卵泡,卵泡體積較大,且突出于卵泡表面,少見黃體,發(fā)情前期是最適宜的小鼠超排時期。因此本試驗選擇發(fā)情前期的3周齡性未成熟小鼠,超排后獲得的卵巢發(fā)育較好,卵泡較多,少見黃體等。有文獻報道[14-16],適宜的超排劑量與時間對于卵泡發(fā)育數(shù)量有很大的影響。因此在選擇超排劑量時,應(yīng)注意根據(jù)參考文獻及實際情況適當(dāng)調(diào)節(jié)超排劑量與時間,避免因超排而導(dǎo)致小鼠卵巢卵泡發(fā)育問題或質(zhì)量不佳等,從而導(dǎo)致提取出來的顆粒細胞量少,無法正常培養(yǎng)。體視顯微鏡下觀察超排狀態(tài)好的卵巢形態(tài)應(yīng)該為干凈、大量卵泡突出于卵巢皮質(zhì),較少或基本沒有黃體、紅體的存在。在刺破卵泡時,將卵巢置于含有血清的培養(yǎng)基中,分離出的顆粒細胞優(yōu)于置于PBS中,可能原因是需要刺破的卵巢卵泡較多,其放置在操作液中的時間較長,如果直接選用PBS,細胞沒有一個適合的生存環(huán)境,將造成更大量細胞的死亡。根據(jù)上述方法分離,培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細胞24 h后貼壁較多,48 h細胞舒展開,體積變大,4～5 d后鋪滿板底。

雞等級卵泡顆粒細胞的提取使用酶消化法[17-18]。在機械分離等級卵泡顆粒層時極易因為將卵黃傾倒干凈,而丟失顆粒層,因此操作過程中注意卵黃倒出程度。提取出的細胞培養(yǎng)24 h后完全貼壁,72 h鋪滿板底,生長狀態(tài)良好。雞小黃卵泡顆粒細胞使用酶消化法提取,在已報道的文獻[19-20]基礎(chǔ)上進行改進。本試驗對直接剝離顆粒層與未剝離比較。采用直接剝離顆粒層的方法時,剝離出來的顆粒層易碎,無法完全收集,PBS清洗2～3次后,最終收集到的顆粒細胞較少。而只擠出卵泡中卵黃來提取顆粒細胞的方法,顆粒層并未脫離卵泡膜層,擠出卵黃后,直接夾取卵泡進行清洗,此方法所收集到的顆粒細胞數(shù)量遠大于直接剝離顆粒層,且生長狀況由于直接剝離的方法,可能是由于直接剝離的方法導(dǎo)致取出的顆粒層特別碎,無法很好的收集。而顆粒細胞呈聚集生長,細胞數(shù)量較少,導(dǎo)致細胞生長狀態(tài)較差。同時需要注意在擠出卵黃時,先使卵黃自行流出,再輕輕按壓卵泡即可,若力氣過大,會使卵黃連同顆粒層一起擠壓出來,不能充分分離提取顆粒細胞。

由于種屬的不同導(dǎo)致小鼠與雞的卵巢顆粒細胞提取方法不同,且小鼠卵巢顆粒細胞與雞卵泡顆粒細胞形態(tài)上與生長特性也存在一定差異。偽足能夠擴大細胞表面積,主要功能是運動和幫助進行營養(yǎng)物質(zhì)交換,與細胞生長發(fā)育密切相關(guān)。雞卵泡顆粒細胞偽足較多,可能是雞為連續(xù)產(chǎn)蛋動物,每隔25 h左右排卵一次,顆粒細胞活力旺盛,對于周圍營養(yǎng)物質(zhì)的攝取較多。而小鼠發(fā)情周期為4～5 d,排卵周期較長,因此相對雞卵泡顆粒細胞的偽足少。

FSHR是卵巢顆粒細胞特異性表達的受體[21],通過細胞間接免疫熒光的方法,可以鑒定出細胞的特異性并對其純對進行檢測。試驗結(jié)果表明,根據(jù)上述分離、提取顆粒細胞的方法,可以有效提出顆粒細胞,且純度高于95%,符合后續(xù)實驗的要求。

綜合分析小鼠卵巢顆粒細胞與雞不同等級卵泡顆粒細胞的分離方法,可知不同種屬因為個體差異、卵泡形態(tài)差異,所需的有效提取方法不一樣。同一種屬不同等級卵泡因為卵泡大小的差異,導(dǎo)致在分離顆粒層的操作上需有所改變。同時在提取過程中,需要注意不同提取方法的要點,以便得到質(zhì)量更好的顆粒細胞。